indivíduos do estudo, espécimes clínicos e genotipagem HLA. Todos os indivíduos com história de transfusão sanguínea foram excluídos do estudo. Trinta e duas famílias com história de esclerodermia simplex foram recrutadas e estudadas para alelos de classe II e I da HLA; três gerações foram estudadas para 20 famílias e duas gerações para 12 famílias. Três gerações foram necessárias para a entrada de estudo para todas as mulheres com filhos, e a participação de todas as crianças foi necessária porque o microchimerismo poderia derivar da mãe ou de uma criança nestes assuntos. A participação de homens, crianças e mulheres nunca grávidas incluiu 2 gerações (ou seja, o sujeito e a mãe). Um dos doentes com esclerodermia era um gémeo; o gémeo Não Afectado foi também recrutado para o estudo. Trinta e três famílias de controle saudável foram recrutadas, incluindo 22 com 3 gerações e 11 com 2 gerações. A genotipagem HLA foi concluída para um total de 254 indivíduos: 128 em famílias de esclerodermia e 126 em controlos. Alguns membros da família adicionais foram incluídos para confirmar HLA haplotype atribuições. A partir desta base de dados, os indivíduos foram selecionados para estudo adicional quando a mãe do sujeito tinha um alelo HLA não-shared que foi alvo por testes específicos HLA. Todos os sujeitos receberam consentimento informado, tal como aprovado pelo Conselho de revisão Institucional do centro de Investigação do Cancro de Fred Hutchinson.

PBMCs foram isolados a partir de sangue heparinizado inteiro por diluição em HBSS, seguida de centrifugação de gradiente Ficoll-Hypaque (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suécia) a 1, 077 g / mL. Para algumas crianças, o DNA foi extraído das raízes do cabelo para a tipagem HLA como descrito anteriormente (9). O DNA genômico foi extraído de PBMCs usando um Kit de extração Nucleica Isoquico (Orca Research Inc., Bothell, Washington, EUA), de acordo com as instruções do fabricante, e ressuspendidos em Tris-HCl 10 mM (pH 9.0). A quantidade e pureza do ADN foram determinadas por métodos espectrofotométricos padrão. Para alguns indivíduos, o ADN foi extraído directamente de amostras de sangue total.a tipagem baseada no ADN com painéis de sonda de oligonucleótidos específicos de sequência foi utilizada para identificar alelos específicos nos loci DRB1, DRB3, DRB4, DRB5, DQA1 e DQB1. Para o DRB1, um ensaio inicial de baixa resolução detecta famílias DRB1 DBR1*01 a DRB1*14 e é seguido por 1 ou mais ensaios de alta resolução que identificam alelos DRB1 específicos, tal como descrito anteriormente (10, 11). Os alelos DQA1 e DQB1 foram determinados utilizando métodos semelhantes aos descritos anteriormente (9), com sondas adicionais adicionadas para detectar alelos recentemente identificados (12). Os antigénios de classe I da HLA foram determinados utilizando um ensaio padrão de linfocitotoxicidade que discrimina os antigénios 20 HLA-a, 30 HLA-B e 8 HLA-Cw. Algumas amostras foram submetidas a sequenciação para determinar alelos específicos da classe I de HLA (13). Para confirmar as atribuições de HLA allele e antigénios e homozigosidade, vários membros da família foram genotipados – incluindo pais e irmãos de indivíduos, quando disponíveis.iniciadores PCR específicos para HLA. As sequências de Primer foram projetadas com base em todas as sequências de alelos conhecidas (12). A síntese de Primer foi feita por Oligos Etc. (Wilsonville, Oregon, EUA). Um conjunto de iniciadores foi projetado para atingir um polimorfismo de classe I da HLA e três polimorfismos de classe II da HLA. Para segmentar HLA-B44, uma cartilha que amplifica um grupo de HLA-B alelos baseado em polimorfismos nas posições 66, 69 e 75 do éxon 3 e outro grupo de HLA-B alelos com base em um polimorfismo na posição 229 do exão 3. A combinação de iniciadores especificamente amplifica alelos HLA-B44, produzindo um fragmento de 190-bp. Todos os primários específicos da DRB foram projetados para amplificar grupos alélicos baseados em polimorfismos de sequência na região hipervariável de exon 2. Para HLA-DRB5*01, um primer amplifica um grupo de DRB5*01 alelos baseado em polimorfismos nas posições 25, 26, 31, 32 e 38, e o outro, o que amplia um grupo de DRB5*01 alelos baseado em polimorfismos entre as posições 215 e 231. A combinação de iniciadores especificamente amplifica HLA-DRB5*01 alelos, produzindo um fragmento de 210-bp. Para HLA-DRB1*04, um primer amplifica um grupo de DRB1*04 alelos baseado em polimorfismos nas posições 25, 26, 31 e 36, e o outro, o que amplia um grupo de DRB1*04 alelos baseado em polimorfismos nas posições 97 e 110. A combinação de iniciadores especificamente amplifica DRB1 * 04, produzindo um fragmento 104-bp. Mais discriminação entre os alelos DRB1*04 foi alcançada usando o primer anterior, juntamente com 1 de 2 primeros que discriminam um dimorfismo na posição 258 (codon 86), produzindo um fragmento de 263-bp. Para HLA-DRB1*11, um primer amplifica um grupo de DRB1*11 alelos baseado em polimorfismos nas posições 25, 26, 28, 30, 31, 32, e 35 do éxon 2, e a segunda cartilha amplifica um grupo de DRB1*11 alelos baseado em polimorfismos nas posições 173 e 174 do éxon 2. The combination of primers specifically amplifies DRB1*11 and produces a 178-bp fragment. Primer sequences are as follows: B44-specific primers 5′-TCC GCG GGT ATG ACC AGG A-3′ and 3′-TCC AGG TAT CTG CGG AGC G-5′; DRB5*01-specific primers 5′-TTC TTG CAG CAG GAT AAG TAT-3′ and 3′-GTA GTT GTC CAC CGC GGC G-5′; DRB1*04-specific primers 5′-CCA CGT TTC TTG GAG CAG GTT AAA-3′ and 3′-GCG CAC GTA CTC CTC TTG GTG-5′; DRB1*11-specific primers 5′-CA CGT TTC TTG GAG TAC TCT AC-3′ and 5′-CTG GCT GTT CCA GTA CTC CT-5′.

HLA-specific PCR for maternal microchimerism. As reações de PCR foram realizadas em um volume de 50 µL, contendo a 1,25–1,5 µg do DNA genômico, 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3), 50 mmol/L de KCl, 1.5 mmol MgCl2, de 0,001% peso/vol gelatina, 260 µmol/L de cada desoxinucleótidos, 0.5 U combinação Perfeita de PCR Enhancer (Stratagene, La Jolla, Califórnia, EUA), 2,5 U de AmpliTaq Gold DNA polimerase (Perkin-Elmer applied Biosystems, Foster City, Califórnia, EUA), e 20 pmol de cada HLA-de primers específicos. Adicionou-se água de ultrapura para perfazer o volume final de 50 µL. Amplificação consistiu de 5 minutos a 96°C, 35 ciclos de 95°C por 35 segundos, e a 65°C por 35 segundos para HLA-B44 (58.5°C para DRB5*01; 72°C por DRB1*04; 64.5°C para DRB1*11), 72°C por 1 minuto, com uma etapa de extensão final a 72°C por 10 minutos. Amplificação óptima, sensibilidade e especificidade foram conseguidas através da titulação de MgCl2, e concentrações de iniciadores, número de termociclos e temperatura de recozimento. Todas as amplificações foram realizadas em um sistema de GeneAmp 9600 thermocycler (Perkin-Elmer Applied Biosystems). A sensibilidade do ensaio foi determinada através de experiências enriquecedoras em que o ADN-alvo foi diluído em série e adicionado a uma quantidade fixa de ADN de fundo correspondente a alelos do sujeito. Os testes de PCR específicos de HLA-B44-e DRB5 * 01 foram capazes de detectar pelo menos uma célula alvo em um fundo de 500.000 células; os testes de PCR específicos de HLA-DRB1*04– e DRB1*11 foram capazes de detectar pelo menos uma célula alvo em um fundo de 100.000 células. Cada ensaio PCR incluiu os seguintes controlos: a) um controlo positivo do ADN a partir de uma linha celular com o alelo interessante HLA (0, 2–0, 5 µg); b) um controlo positivo da mãe do indivíduo (0,2–0,5 µg); C) controlos negativos de ADN a partir de uma linha celular com os mesmos alelos HLA que o indivíduo (1,25 µg e 0,35 µg); e d) um controlo negativo constituído por todos os reagentes PCR sem ADN. Os produtos PCR foram electroforizados a uma tensão constante de 100 V durante 1 hora em 6% ou 8% de gel pré-fabricadas do TBE usando uma Mini-célula Novex Xcell II (Novex, San Diego, Califórnia, EUA). Cada gel incluía controles PCR positivos e negativos e uma escada 100-bp (SLL-100; Gensura, Del Mar, Califórnia, EUA). Os géis estavam manchados de prata (Silver Stain Plus Kit, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, Califórnia, EUA) e seco com o sistema de secagem em Gel de DryEase (Novex). O ADN extraído do sangue total foi testado em 4 amostras de quantidade insuficiente para isolar PBMCs. Todos os testes foram feitos em duplicado, e a maioria das amostras foram avaliadas mais de uma vez.medidas de precaução da PCR. Foi utilizada uma precaução extrema para evitar e detectar possível contaminação por PCR. Áreas separadas foram usadas para separação PBMC, extração de DNA genômico, configuração e amplificação PCR, e análise de produtos PCR, com testes antes e depois PCR realizados em laboratórios separados. Pontas de pipeta resistentes ao aerossol (Molecular Bio-Products Inc., San Diego, Califórnia, EUA) foram usados em todos os experimentos, e vários controles negativos foram incluídos em todas as amplificações PCR.sequenciação de produtos PCR específicos para HLA. Sete microlitros do produto inicial de PCR específico do HLA foram submetidos a 40 ciclos adicionais de amplificação utilizando os parâmetros de termociclagem originais. Trinta microlitros deste produto de PCR foi electrophoresed em 1.75% ultrapuros gel de agarose (GIBCO BRL, Grand Island, Nova York, EUA) e corados com solução de brometo de etídio (0,5 µg/mL). A banda foi excisada, eludida e purificada usando um Kit de Extração De Gel QIAquick (QIAGEN Inc., Valencia, California, USA). O produto de PCR purificado foi eluídas em 30 µL de 10 mmol de Tris-HCl (pH 9.0), e 100 ng foi adicionada a uma mistura de reacção contém 8.0 µL de seqüenciamento de reagentes pré-mix (Thermo Sequenase; Amersham Corp., Arlington Heights, Illinois, EUA), 12.Iniciador de 5 pmol 5′ ou 3′ e 1 µL DMSO (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA). Adicionou-se água Ultrapure para obter um volume final de 20 µL. As misturas de reação de sequenciamento foram aquecidas a 96 ° C por 3 minutos em um sistema de GeneAmp 9600 termociclador, seguido por 25 ciclos a 96°C por 10 segundos, 50°C por 5 segundos, e 60°C por 4 minutos. Os produtos de PCR resultantes foram purificados em coluna e electroforizados como acima indicado. Sequências sensoriais e antissensivas foram determinadas em duplicado para os produtos de PCR específicos do sujeito e da mãe, bem como para produtos de PCR de linha celular de controle positivo. A análise de sequência foi realizada usando o pacote de Wisconsin versão 9.1 software do Genetics Computer Group (Madison, Wisconsin, EUA).preparação de lâminas Citospínicas e hibridização in situ. Cytospin apresentação de preparações foram analisadas para a presença de X e o cromossoma Y–de sequências específicas, utilizando uma técnica desenvolvida no Fred Hutchinson Cancer Research Center Citogenética Molecular Laboratório para análise quantitativa de chimerism no sexo incompatíveis transplante de células-tronco pares (14). Amostras de citospina de células masculinas foram preparadas por centrifugação de 30.000–60.000 PBMCs recém-separados em lâminas de vidro, 300 µL por lâmina. As lâminas foram armazenadas numa câmara de dessecação até à sua utilização. A sonda específica do cromossomo X DXZ1 (15) foi traduzida com a digoxigenina, e a sonda específica do cromossomo Y DYZ1 (16) foi traduzida com a biotina. O gráfico de DISPERSÃO sonda mistura tinha uma concentração final de 0,5 µg/mL de cada sonda em tampão de hibridação de 50% formamide, 2× SSC (0,3 M de cloreto de sódio e 0,03 M de citrato de sódio ), e 10% de dextran sulfato. Foi desnaturado a 72 ° C durante 5 minutos, arrefecido sobre gelo, e aplicado ao diapositivo. As lâminas foram digeridas em pepsina (0, 1 mg/mL em 0.01 M HCl) a 37 ° C durante 3 minutos, fixados em formalina tamponada a 4% durante 15 minutos, enxaguados em PBS, desidratados em etanol (70%, 95% e 100%) e secos ao ar. As lâminas foram desnaturadas por tratamento em 2× SSC (72 ° C) durante 10 minutos, 70% de formamida, 2× SSC (72°C) durante 3 minutos, desidratadas numa série de etanol (-20°C) e secas ao ar. Dez microlitros de sonda foram aplicados na lâmina e, em seguida, montados sob um revestimento (22 × 22 mm) selado com cimento de borracha. Foi incubado durante a noite a 42 ° C numa câmara humidificada. As lâminas foram lavadas em 55% de formamida, 2× SSC (45 ° C) durante 15 minutos e 2× SSC (temperatura ambiente) durante 5 minutos. Detectaram-se sinais de sonda simultaneamente com anti-digoxigenina acoplada com fluoresceína (diluição de 1:500; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana, EUA) e Avidin acoplada com vermelho do Texas (diluição de 1:500; Vector Laboratories, Burlingame, Califórnia, EUA) durante 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. Depois de lavadas com 2× SSC e PBS, elas foram montadas com VECTASHIELD (laboratórios vetoriais). As lâminas foram avaliadas diretamente utilizando um microscópio de epifluorescência Nikon E600 com uma lâmpada de mercúrio de 100 W equipada com filtros de passagem simples, duplos e triplos. Apenas células com 2 sinais cromossómicos visíveis foram enumeradas, sem utilização de qualquer reforço electrónico.