Activation of RNase H

RNase H is a ubiquitous enzyme that degrada the RNA strand of an RNA-DNA duplex. Foi identificado em organismos tão diversos como vírus e células humanas (Crouch e Dirksen, 1985). Pelo menos duas classes de RNase H foram identificadas em células eucarióticas. Foram observadas múltiplas enzimas com actividade RNase H em procariotas (Crouch e Dirksen, 1985). Embora RNase H esteja envolvida na replicação do DNA, ele pode desempenhar outros papéis na célula e é encontrado no citoplasma, bem como no núcleo (Crum et al., 1988). No entanto, pensa-se que a concentração da enzima no núcleo seja maior e que algumas das enzimas encontradas em preparações citoplásmicas possam ser devidas a fugas nucleares.

os elementos precisos de reconhecimento para RNase H não são conhecidos. No entanto, tem sido mostrado que oligonucleotídeos com propriedades semelhantes ao DNA, tão curtos quanto tetramers podem ativar RNase H (Donis-Keller, 1979). As alterações na activação da RNase H sob a forma de modificações do açúcar que resultam em oligonucleótidos semelhantes ao ARN, por exemplo, 2′-fluoro ou 2′-metoxi, não parecem servir como substratos da RNase H (Sproat et al., 1989; Kawasaki et al., 1993). As alterações na orientação do açúcar para a base podem também afectar a activação da RNase H, uma vez que OS α-oligonucleótidos são incapazes de induzir a RNase H ou podem requerer o recozimento paralelo (Gagnor et al., 1989; Morvan et al., 1991). Adicionalmente, as modificações da coluna vertebral influenciam a capacidade dos oligonucleótidos para ativar a RNase H. Os metilfosfonatos não activam a RNase H (Maher et al., 1989; Miller, 1989). Em contraste, os fosforotioatos são substratos excelentes (Cazenave et al., 1989; Mirabelli et al., 1991; Stein and Cheng, 1993). Além disso, as moléculas quiméricas foram estudadas como oligonucleótidos que se ligam ao ARN e ativam a RNase H (Furdon et al., 1989; Quartin et al., 1989). Por exemplo, oligonucleótidos compostos por asas de fosfonatos 2′-metoxi e um intervalo de cinco bases de desoxioligonucleótidos ligam-se ao seu ARN-alvo e activam a RNase H (Furdon et al., 1989; Quartin et al., 1989). Além disso, um único ribonucleótido numa sequência de desoxirribonucleótidos demonstrou ser suficiente para servir de substrato para a RNase H quando ligado ao seu desoxi-oligonucleótido complementar (Eder e Walder, 1991).foi também demonstrado que é possível tirar partido dos oligonucleótidos quiméricos concebidos para activar a RNase H e que têm maior afinidade para os seus receptores de ARN e para aumentar a especificidade (Giles e Tidd, 1992; Monia et al., 1993). Num estudo, a clivagem da transcrição alvo mediada pela RNase h foi muito mais selectiva quando os desoxioligonucleótidos compostos por asas de metilfosfonato deoxioligonucleótido e lacunas de fosfodiésteres foram comparados com oligonucleótidos fosfodiester completos (Giles e Tidd, 1992).

apesar da informação sobre a RNase H e da demonstração de que muitos oligonucleótidos podem ativar a RNase H em ensaios de lisados e enzimas purificadas, relativamente pouco se sabe sobre o papel das características estruturais nos alvos de ARN na ativação da RNase H (Minshull and Hunt, 1986; Gagnor et al., 1987; Walder and Walder, 1988). De fato, a prova direta de que a ativação da RNase H é, de fato, o mecanismo de ação dos oligonucleotídeos nas células tem faltado, até muito recentemente.estudos recentes em nossos laboratórios fornecem insights adicionais, embora indiretos, sobre estas questões. ISIS 1939 é um fosforotioato de 20 mer complementar a uma sequência na Região 3′ – não traduzida de RNA ICAM-1 (Chiang et al., 1991). Inibe a produção de ICAM nas células endoteliais da veia umbilical humana e blots do Norte demonstram que o mRNA ICAM-1 está rapidamente degradado. Um análogo 2 ‘ – metoxi do ISIS 1939 mostra maior afinidade para o ARN do que o fosforotioato, é estável nas células, mas inibe a produção de proteína ICAM-1 muito menos potentemente do que o ISIS 1939. É provável que ISIS 1939 desestabiliza o RNA e ativa RNase H. Em contraste, ISIS 1570, uma 18-mer phosphorothioate que é complementar à tradução de iniciação codão de ICAM-1 mensagem inibiu a produção da proteína, mas não causou nenhuma degradação do RNA. Assim, dois oligonucleótidos que são capazes de ativar RNase H tiveram efeitos diferentes dependendo do local no mRNA a que se ligaram (Chiang et al., 1991). Uma demonstração mais directa de que a RNase H é provavelmente um factor-chave na actividade de muitos oligonucleótidos antisense foi fornecida por estudos nos quais a PCR de ligação reversa foi utilizada para identificar produtos de clivagem do mRNA bcrabl em células tratadas com oligonucleótidos fosforotioatos (Crooke et al., 1995).

Dado o papel emergente da quimérica oligonucleotídeos com modificações na 3′ e 5′-asas projetado para aumentar a afinidade com o destino de RNA e nuclease estabilidade e um DNA-tipo de diferença para servir como substrato para RNase H, estudos focados em entender os efeitos de várias modificações na eficiência da enzima(s) são também de grande importância. Num desses estudos sobre a E. coli RNase H, temos relatado que a enzima apresenta especificidade de sequência mínima e é processiva. Quando um oligonucleótido quimérico com açúcares 2′ modificados nas asas foi hibridizado com o ARN, o local inicial de clivagem foi o nucleótido adjacente à junção metoxi-desoxi mais próximo do substrato de 3′-Fim do ARN. A taxa inicial de clivagem aumentou à medida que o tamanho do gap de DNA aumentava e a eficiência da enzima era consideravelmente menor contra um alvo RNA duplexado com um oligonucleótido quimérico anti-senso do que um oligonucleótido completo do tipo DNA (Crooke et al., 1995).em estudos subsequentes, avaliamos as interações de oligonucleótidos anti-senso com alvos estruturados e não estruturados, e os impactos dessas interações na RNase H em mais detalhes (Lima e Crooke, 1997). Usando uma série de substratos não-cliváveis e análises Michaelis-Menten, fomos capazes de avaliar a ligação e clivagem. Nós mostramos que, de fato, a E. coli RNase H1 é uma proteína de ligação de RNA de dupla cadeia. O Kd para o ARN duplex foi de 1,6 µM; o Kd para um DNA duplex foi de 176 µM; e o Kd para DNA de cadeia única foi de 942 µM. Em contraste, a enzima só conseguia clivar RNA num duplex RNA-ADN. Qualquer alteração de 2’no fármaco anti-defesa no local de clivagem inibiu a clivagem, mas a redução significativa da carga e 2′-modificações foram toleradas no local de ligação. Por último, a colocação de uma carga positiva (por exemplo, 2′-propoxiamina) no fármaco anti-defesa reduziu a afinidade e a clivagem. Examinámos também os efeitos das estruturas de ARN induzidas por oligonucleótidos antissensivos na actividade da E. coli RNase H1 (Lima e Crooke, 1997). Qualquer estrutura no substrato duplex teve um efeito negativo significativo na taxa de clivagem. Além disso, a clivagem de locais selecionados foi totalmente inibida, e isso foi explicado pelo impedimento estérico imposto pelo laço de ARN atravessando os sulcos menores ou maiores ou o heteroduplex. Recentemente clonámos e expressámos a RNase humana H1. A proteína é homóloga da E. coli RNase H1, mas tem propriedades semelhantes às descritas para a RNase h humana tipo 2 (Frank et al., 1994; Wu et al., 1998). A enzima é estimulada por baixas concentrações de Mg2+, inibida por concentrações mais elevadas, e é inibida por Mn2+ na presença de Mg2+. É de 33 kDa em peso molecular. É uma proteína de ligação de RNA de dupla cadeia e exibe preferências posicionais e sequenciais únicas para clivagem (Wu et al., 1999). Adicionalmente, a RNase H2 humana foi clonada, mas até à data a proteína expressa não demonstrou ser activa (Frank et al., 1998). Muito recentemente, temos relatado sobre os efeitos de várias mutações introduzidas na RNase humana H1 na actividade da enzima (Wu et al., 2000). Assim, temos agora as ferramentas necessárias para começar a explorar os papéis da RNase h humana nos processos biológicos e farmacológicos e para começar a desenvolver medicamentos concebidos para interagir com eles de forma mais eficaz.

finalmente, pelo menos no que diz respeito à degradação do ARN alvo induzida pela RNase h, demonstrámos recentemente que no intervalo de 1-150 cópias de ARN por célula, o nível de ARN alvo não tem efeito na potência dos inibidores antissensivos (Miraglia, 2000). Isto é devido ao fato de que o número de moléculas de antisense de drogas por célula excede o número de cópias de RNA por várias ordens de magnitude. Assim, outros factores devem ser a limitação da taxa.