um método de transferência de genes para células de mamíferos é altamente eficiente através da infecção por vectores retrovirais. A eficiência da infecção retroviral é aumentada significativamente, 100 a 1000 vezes em algumas células, incluindo polibreno durante a infecção. Polibreno com um choque DMSO também é usado para mediar a transferência de DNA em uma variedade de tipos de células, tais como CHO, fibroblastos de embriões de galinha, NINH-3T3 e células mielóides. Protocolo: Infecção Retroviral
As populações retrovirais recombinantes são preparadas adicionando 5mls de meio de crescimento com soro de 5% a um monolayer próximo confluente de células de embalagem retroviral transfectadas numa placa de 100 mm. Após 24 horas, o meio é removido e filtrado através de um filtro de 0, 45 um.
As células para serem infectadas com esta unidade populacional retroviral recombinante são revestidas a 500.000 células por placa de 100 mm em 10mls de meio completo. 24 horas depois, remova o meio de crescimento das células. Infectar as células com 2mls do sobrenadante viral (ou uma diluição da concentração do vírus em 2mls) na presença de 5 a 10ug de polibreno por ml (concentração final). Incubar as células durante 3 a 6 horas a 37 ° C. adicionar 8mls de meio completo. Três dias após a infecção, dividir as células 1:5 em meio de seleção. Toyoshima, K. and Vogt, P. K., 1969. Virologia. 38: 414-426
Coelen, J. R., Jose, D. G. and May, J. T. 1983. Arco. Virol. 75: 307-311
Protocol: Transfection
Plate cells at approximately 50% confluence in complete growth medium. Nota: Cada componente deve ser adicionado na sequência apropriada.
1st: Complete growth medium (2mls for a 60mm plate and 3mls for
a 100mm plate) warmed to 37°C.
2nd: Plasmid DNA, 10ng to 10ug. Misturar suavemente.
3rd: Polibreno até uma concentração final de 5ug a 10ug por ml. Misturar suavemente o meio da placa e adicionar às células a solução de ADN-meio-Polibreno. Incubar as células a 37 ° C durante 6 a 20 horas, balançando suavemente ocasionalmente aproximadamente a cada 1.5 horas nas primeiras 6 horas. remova a solução de ADN-meio-Polibreno e sobrepõe suavemente as células com a solução de choque DMSO (15% DMSO em 1x HBSS: Specialty Media catalog #S-051-D) 3mls por prato de 60 mm e 4mls por placa de 100 mm. Manualmente rock do prato para 10 segundos para distribuir uniformemente a solução e, em seguida, incubar as células para a exatamente 4 minutos a 37°C.
remover Imediatamente o DMSO choque solução e gentilmente lave as células duas vezes com o completo crescimento médio, 5mls por lavagem por 60mm de prato, 10mls por lavagem por 100mm prato
Adicionar completa meio de crescimento para as células.
para transformantes estáveis, remova o meio de crescimento e divida as células 1:5 em meio de seleção.
Para expressão transitória, remover o meio de crescimento e adicionar meio de crescimento fresco. Células de colheita e / ou meio após 24 a 72 horas.

Chaney, W. G. et al., 1986. Células somáticas e Genética Molecular. Volume. 12, No. 23,
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Aubin, R. J. et al. 1988. Células somáticas e Genética Molecular. Volume. 14, No. 2, 155-167. Chisholm, O. et al., 1998. Pesquisa De Ácidos Nucleicos. Volume. 16, No. 5, 2352
reagente é fornecido filtrado através de membranas 0,2 um e hidratado com H20 estéril.