Picardo gab sein Spielfilmdebüt als Eddie Quist, der Serienmörder Werwolf in dem Joe Dante Film The Howling (1981). Er hatte auch eine wiederkehrende Rolle in der Sitcom Alice und spielte einen Arzt in einer Episode von The Golden Girls. Er spielte eine Reihe von Rollen in Dantes Science-Fiction-Familienfilm Explorers (1985) und erschien später in Dantes The ‚Burbs, Looney Tunes: Back in Action, Matinee, Gremlins 2: The New Batch, Small Soldiers und Innerspace. Picardo spielt oft Rollen unter Schichten von Prothesenlatex, nachdem er auch die im Sumpf lebende Meg Mucklebones in Ridley Scotts Film Legend gespielt hat. Er hatte auch eine kleine Rolle als Bestatter in John Landis ‚ Amazon Women on the Moon. Er spricht Pfish in zwei Pfish & Chip Shorts wie auf Cartoon Network’s What-A-Cartoon gesehen! Karte. Picardo porträtiert auch die Stimme und das Gesicht des Roboters Johnny Cab in Total Recall. Er erschien in einer Episode von ER im Jahr 1995 als Abraham Zimble (Staffel 2 – Episode 6, „Tage wie diese“).Im Jahr 1993 hatte Picardo eine kurze Rolle als Joe „The Meat Man“ Morton, ein Metzger und Nachbar von Tim Allens Charakter auf der Sitcom Home Improvement.Im Jahr 2001 gastierte er in der 7-Tage-Episode „Revelation“ und gab vor, ein Zeitreisender aus sieben Jahren in der Zukunft zu sein.

Im Jahr 2007 spielte er Principal White in Ben 10: Rennen gegen die Zeit. Im Jahr 2007 spielte er in dem Independent-Spielfilm von Regisseur Russ Emanuel, PJ, neben John Heard und Vincent Pastore. Er spielte auch in Russ Emanuels Chasing the Green im Jahr 2008 mit William Devane, Jeremy London und Ryan Hurst.Picardo erschien auf Kojak in einer 1977 Episode, E-Ring, als Medienvertreter im Pentagon, als wütender Vater in Cold Case und als Polizist in CSI: NY. Er war ein wiederkehrender Gaststar in zwei Folgen der Saison 7 von Smallville.

Abseits der Schauspielerei war Picardo von 1999 bis 2015 Mitglied des Board of Directors‘ Advisory Council der Planetary Society; ab 2015 wurde er in den Board of Directors selbst gewählt.

Weitere Höhepunkte seiner Karriere sind der Auftritt in Leonard Bernsteins Messe während seiner Europa-Debüt-Tour, der Auftritt mit der Yale University Society of Orpheus & Bacchus a cappella Singing Group als Student und das Auftreten in Dutzenden anderer Fernseh- und Filmrollen, darunter der Film Unsere letzten Tage als Kinder.

Picardo spielte die Stimme von Loki im Xbox 360-Videospiel Too Human. Im Jahr 2009 trat er auch in Pushing Daisies, Chuck und Castle auf. Ebenfalls 2009 spielte er die Hauptrolle in dem unabhängigen Psychothriller Sensored. Im Jahr 2010 hatte Picardo einen Cameo-Auftritt in der letzten Folge von Persons Unknown als Mitglied des Verwaltungsrates von „the program“. Picardo spricht auch Robert McNamara in Call of Duty: Black Ops in der Kampagne und im „Zombie-Modus“, nachdem er die Kampagne auf der einen Karte abgeschlossen hat, „FÜNF“. Picardo erschien in vier Episoden von The Mentalist von 2012 bis 2013 als Jason Cooper, ein Leutnant des Kultführers Bret Styles.Picardo erschien auch in einer Staffel 6 Episode von Supernatural mit dem Titel „Clap Your Hands if You Believe“, als Kobold.

Im Mai 2014 kündigte Cartoon Hangover Picardo als Gastsprecher in der zweiten Staffel von Bravest Warriors in der Folge „The Parasox Pub“ an.

2017 spielte Picardo Lt. Kitans Vater in der ersten Staffel von The Orville mit dem Titel „Firestorm“ und wiederholte die Rolle in der 2019-Episode „Home“.

Picardo erschien als er selbst in einer Episode von Schooled.

Star Trek

Von 1995 bis 2001 spielte er die Rolle des Emergency Medical Hologram (EMH) in der Fernsehserie Star Trek: Voyager. Bevor Picardo für diese Rolle angenommen wurde, sprach er zunächst für die Rolle des Neelix vor. Später führte er auch Regie bei zwei Episoden.

Er spielte zusätzliche Kopien der Rolle des EMH in dem Film Star Trek: First Contact von 1996 und der Episode „Doctor Bashir, I Presume?“ Er spielte auch Dr. Lewis Zimmerman, den Schöpfer des EMH, in Episoden von Deep Space Nine und Voyager.

Im Jahr 2002 verfasste Picardo das Hologramm-Handbuch, herausgegeben von Pocket Books.In den Jahren 2007 und 2008 war Star Trek: The Music eine Multi-City-Tour mit John de Lancie. Picardo und de Lancie erzählten die Orchesteraufführung und erklärten die Geschichte der Musik in Star Trek.

Im Jahr 2015 wiederholte Picardo die Rolle von Dr. Lewis Zimmerman in der Pilotfolge der Fan-Serie Star Trek: Renegades.

StargateEdit

Im Jahr 2004 begann er die wiederkehrende Rolle des International Oversight Advisory (IOA) Mitglieds Richard Woolsey in Stargate SG-1 und Stargate Atlantis zu spielen. Sein erster Auftritt in dieser Serie war in der Stargate SG-1-Episode „Heroes (Part 2)“.

Am 5. Februar 2008 wurde bekannt gegeben, dass Picardo für die fünfte und letzte Staffel der Serie vollzeit in die reguläre Besetzung von Stargate Atlantis aufgenommen wird. Er übernahm die Rolle des Missionskommandanten der Atlantis-Expedition.