2, 2 Pyruvaattidekarboksylaasi ja substraattien tarjonta

kuten edellä on kuvattu, PDC on L-PAC: n tuotannosta vastaava entsyymi. PDC esiintyy yleensä joko dimeereinä tai tetrameereina, jolloin aktiivinen PDC-holoentsyymi on yleensä olemassa tetrameerinä, kun taas apoentsyymi on olemassa dimeerinä (Pohl, 1997). Dimeeri-ja tetrameerimuotojen olemassaolo on pH-riippuvaista. Hiivassa PDC: tä on raportoitu esiintyvän vain tetrameerinä pH–alueella 5,5-6.5, sekä tetrameereina että dimeereinä, joiden pH-arvo on enintään 9,5, ja dimeereinä vain pH > 9,5 (Pohl, 1997). Hohmann (1997) on kuitenkin raportoinut PDC: n olemassaolon vain dimeerien muodossa pH: ssa 8,4. PDC: tä Z. mobiliksesta on löydetty vain tetrameerien muodossa (Pohl, 1997). Vaikka PDC: n alayksiköillä luultiin aiemmin olevan erilaisia koostumuksia, nykyään niiden tiedetään olevan identtisiä (Hohmann, 1997).

Saccharomyces cerevisiaesta on tunnistettu yhteensä kuusi PDC-geeniä, joista kolme on rakennegeenejä (PDC1, PDC5 ja PDC6) ja loput kolme katsotaan PDC: n ilmentymiseen liittyviksi geeneiksi (Pdc2, PDC3, PDC4) (Flikweert et al., 1996; Hohmann, 1997; Pohl, 1997; ter Schure et al., 1998). Yksi PDC: tä koodaava rakenteellinen geeni on tunnistettu Z. mobiliksessa (Pohl, 1997). Vaikka suurin osa tällä alalla tehdystä työstä näyttää tehdyn S. cerevisiae-hiivalla, PDC-geenejä on tunnistettu useissa hiivalajeissa, Candida utilis-hiivaa lukuun ottamatta. Flikweert ja työtoverit tekivät tutkimuksia arvioidakseen kunkin isoentsyymin roolia PDC: n kokonaisaktiivisuudessa ja havaitsivat, että kunkin isoentsyymin ilmentyminen S. cerevisiaessa poikkesi toisistaan. Käyttämällä eräviljelyä, jossa on joko etanolia tai glukoosia hiilisubstraattina, pdc1 ilmaistiin konstitutiivisesti, kun taas pdc5 indusoitiin glukoosin läsnä ollessa. PDC6-arvo oli mitätön. Nämä havainnot toistuivat hohmannin pyruvaattidekarboksylaaseja koskevassa katsauksessa (1997), joka osoitti, että vain pdc1: llä ja PDC5: llä oli ilmeinen rooli sokerikataboliassa, ja 80-90% ja 10-20% PDC: n kokonaisaktiivisuudesta johtuu näistä kahdesta geenistä glukoosin kasvattamassa biomassassa.

asetoiinin valmistuksen lisäksi S. cerevisiae PDC: n on havaittu osallistuvan fusel-öljyjen valmistukseen, jotka ovat alkoholijuomien ja leivän sisältämiä aromiyhdisteitä. Fuseliöljyjä valmistetaan aromaattisista aminohapoista johdettujen haaraketjuisten 2-oksohappojen dekarboksyloimalla. Tämän jälkeen tuotteet dehydrogenoidaan alkoholidehydrogenaasilla (ADH). PDC: n aktiivisuus 2-oksohappojen kanssa on huomattavasti pienempi kuin pyruvaatilla (ter Schure et al., 1998). Uusien aldehydianalogien tuotantoa käsitellään myöhemmin tässä luvussa.

PDC-aktiivisuutta voidaan indusoida ja manipuloida sekä viljelyyn toimitetun ilmastuksen asteen että viljelyaineessa olevan hiilihydraattisubstraatin valinnan perusteella. PDC-aktiivisuutta tarvitaan glykolyyttisen vuon mahdollistamiseksi vain anaerobisissa olosuhteissa; siksi ilmastuksen vähenemisen pitäisi johtaa PDC: n induktioon. Sekä Sims ja työkaverit (1991) ja Rogers et al. (1997) ovat osoittaneet, että C. utilis PDC: n aktiivisuus lisääntyy, kun happipitoisuus pienenee. Tällainen vaste on erittäin hyödyllinen l-PAC: n tuotannolle. Molemmat tutkijaryhmät kuitenkin havaitsivat, että ei-toivottujen sivutuotteiden tuottamisesta vastaavan ADH: n aktiivisuus ylittää PDC: n toiminnan anaerobisissa tai osittain anaerobisissa olosuhteissa. Ilmastusolosuhteiden vaikutusta hiivan fysiologiaan käsitellään myöhemmin tässä luvussa.

hiilihydraattilähteen aiheuttama PDC-aktiivisuuden induktio riippuu käytetystä hiivalajista ja sen sisältämästä hiilihydraattilähteestä. Glukoosi on yksi substraatti, joka kykenee indusoimaan glykolyyttisiä entsyymejä, erityisesti PDC: tä. Useat työntekijät ovat osoittaneet, että glukoosin lisääminen viljelmiin johtaa PDC-aktiivisuuden lisääntymiseen. Maitra and Lobo (1971) havaitsi, että glukoosin lisääminen pulssina Saccharomyces spp. viljelmät lisäsivät glykolyyttisten entsyymien tuotantoa, mukaan lukien PDC, lyhyen viiveen jälkeen. Kasvualustana käytettiin hiilihydraattitonta ja hiilen lähteenä käytettiin asetaattia. Samoin Schmitt and Zimmerman (1982) osoitti S. cerevisiae: n PDC-aktiivisuuden 18-kertaistuneen sen jälkeen, kun glukoosia lisättiin ravistuspulloviljelmään, jota kasvatettiin etanolilla ainoana hiilihydraattilähteenä. Nämä tulokset ovat yhtäpitäviä Harrisonin (1972) ja Sims et al. (1991). Sims ja työtoverit osoittivat myös PDC-aktivaation palautuvan luonteen. Ne osoittivat, että anaerobisissa olosuhteissa, kun glukoosia ei saatu (sentrifugoimalla ja sekoittamalla biomassaa glukoosittomassa elatusaineessa), C. utilisin PDC-aktiivisuus väheni 50 prosenttia. PDC-aktiivisuus palautui lisäämällä glukoosia väliaineeseen anaerobisissa olosuhteissa; jos viljelmä kuitenkin ilmastettiin glukoosilisän lisäksi, PDC-aktiivisuus ei muuttunut. Tällaista entsyymi-aktivaatiota ei tapahdu kaikilla hiilihydraattityypeillä. Kun hiivalajeja kasvatetaan anaerobisesti kluyver-vaikutuksen antavilla glykosideilla, PDC-aktiivisuus vähenee verrattuna glykosideihin, kuten glukoosiin, joka voi metaboloitua anaerobisesti (Sims ja Barnett, 1991). Tutkimuksensa tuloksena he havaitsivat, että PDC: n aktiivisuus saattaa rajoittaa nopeutta anaerobisissa olosuhteissa. Tämä havainto on yhtäpitävä Van Urkin ym.tekemän päätelmän kanssa. (1989).

PDC on substraattipyruvaattiaktivoitu entsyymi (Hubner ym., 1978; Hohmann, 1997), jota myös epäorgaaninen fosfaatti estää allosteerisesti (Boiteux and Hess, 1970). Boiteux ja Hess raportoivat S. carlsbergensiksen puhdistetun PDC: n Michaelis-vakion (Km) lisääntyneen 1, 3 mm: stä epäorgaanisen fosfaatin puuttuessa noin 11 mM: iin 100 mm: n fosfaatin läsnä ollessa. Estovaikutus määritettiin luonteeltaan kilpailevaksi, eikä Km: n vaihtelu vaikuttanut entsyymin maksimiaktiivisuuteen. PDC: n herkkyys fosfaatin aiheuttamalle inhibitiolle määritettiin samaa suuruusluokkaa kuin sen herkkyys pyruvaatin aiheuttamalle aktivaatiolle.

Saccharomyces spp. ja C. utilisia käytetään yleisesti l-PAC: n tuotannossa; varhaistyössä entsyymitoimintaa ei kuitenkaan juurikaan verrattu suoraan. S. cerevisiae ja C. utilis vertailivat van Dijken and Scheffers (1986), ja van Urk et al. (1989). He määrittivät, että S. cerevisiae-bakteerin PDC: n aktiivisuus oli noin kahdeksan kertaa suurempi kuin C. utilis-bakteerin PDC: n, vaikka edellisen PDC: n todettiin olevan herkempi fosfaatin aiheuttamalle inhibitiolle. Fosfaatin osalta C. utilis-bakteerin PDC: ssä oli samanlaiset Km-arvot kuin S. carlsbergensis-bakteerin PDC: ssä, eli 3.6 mm fosfaatin puuttuessa ja 11 mm fosfaatin ollessa 100 mm. Sen sijaan S. cerevisiae-bakteerin PDC: ssä Km-arvot olivat 3,0 mm ilman fosfaattia ja 48 mm 100 mm fosfaattia. Näin ollen fosfaatin saatavuudella on tärkeä rooli PDC: n toiminnassa ja siten PDC: n tuottavuudessa. Van Urk ym. ehdottivat fosfaatin sytosolipitoisuuden pienenemisen ja pyruvaattipitoisuuden nousun yhdistelmää. (1989) myötävaikuttavina tekijöinä PDC-aktiivisuuden lisääntymiseen sen jälkeen, kun viljelmä on syljetty glukoosilla. Oliver et al. (1997) siihen liittyi melassilla sykkimistä käymisen puolivälissä, joten vastaava PDC: n aktiivisuuden lisääntyminen olisi mitä todennäköisimmin johtanut siihen.

merkittävää työtä ovat tehneet Rogers ja työtoverit (Chow et al., 1995; Shin and Rogers, 1996a; Rogers et al., 1997) arvioimaan C. utilisin PDC: n kinetiikkaa sekä puhdistetussa muodossa että kokonaisissa soluissa. He kirjasivat PDC–aktiivisuuden 0,85-0,9 U/mg proteiinia koko stationaarifaasisessa biomassassa erän viljelyn kasvun jälkeen. Osittaisen puhdistuksen jälkeen Chow et al. (1995) havaittiin PDC: n aktiivisuuden lisääntyneen 4,8 U/mg proteiiniin, mikä oli verrattavissa kaupallisesti saatuun PDC: hen. Pohl (1997) ehdottaa, että hiivasta ja kasveista puhdistetulle PDC: lle voidaan saavuttaa 45-60 U/mg: n erityinen aktiivisuus.

Rogers et al. (1997) Raportoi useita kineettisiä parametreja puhdistetulle PDC: lle C. utilikselta. Bentsaldehydin Km-arvot olivat 42 mm (4 °C, pH 7,0) ja pyruvaatin 2,2 mm (25 °C, pH 6,0), ja niiden pitoisuudet olivat yli 10 mm pyruvaattia kyllästymisolosuhteiden aikaansaamiseksi. Asetaldehydin inhibitiovakio (Ki) oli noin 20 mm, kun taas substraatin inhibitio oli havaittavissa yli 180 mm: n (19,1 g/l) bentsaldehydipitoisuuksilla.

Chow et al. (1995) teki tutkimuksia PDC: n deaktivoinnin kinetiikan määrittämiseksi bentsaldehydillä. He totesivat, että deaktivointi seurasi ensimmäisen asteen kinetiikkaa bentsaldehydin osalta; vaste ei kuitenkaan ollut lineaarisesti verrannollinen aikaan, kun bentsaldehydipitoisuus oli 100-300 mm.

suuressa osassa l-PAC: n tuotantoa koskevaa työtä PDC: n ei ole havaittu rajoittavan l-PAC: n tuotantoa (Vojtisek and Netrval, 1982; Shin and Rogers, 1996a; Tripathi et al., 1997), koska jonkin verran PDC-aktiivisuutta jäi fermentaatioiden loppuun. Sen sijaan sekä Tripathi että työtoverit (1997) että Vojtisek ja Netrval (1982) havaitsivat, että pyruvaattipitoisuus oli alhainen keskisuurissa, rajoitetuissa sadoissa. Sekä Tripathi että työtoverit, ja Nikolova and Ward (1991), pitivät glykolyyttisiä entsyymejä mahdollisina nopeusrajoituksina.

edellä esitettyjen tietojen perusteella Oliver et al. (1997) (KS.4 jakso) vaikuttaa erittäin suotuisalta l-PAC: n tuotannolle. Pyruvaattia esiintyy merkittäviä määriä, ja hohmannin (1997) mukaan pyruvaattidehydrogenaasin kapasiteetti on rajallinen verrattuna PDC: hen, mikä rajoittaa pyruvaatin metaboliaa ainoan vaihtoehtoisen reitin kautta. Lisäksi biomassaa täydennetään hiilihydraatilla yhdessä pienemmän ilmastuksen kanssa. The work of Sims ja Barnett (1991) ja Sims et al. (1991) osoittaa, että näiden kahden ehdon yhdistelmä edistää PDC: n induktiota.