2.2 Piruvat decarboxilază și furnizarea de substraturi

așa cum este descris mai sus, PDC este enzima responsabilă pentru producerea de l-PAC. PDC se constată de obicei că există fie ca dimeri, fie ca tetrameri, prin care holoenzima PDC activă există în general ca tetramer, în timp ce apoenzima există ca dimer (Pohl, 1997). Existența formelor dimer și tetramer este dependentă de pH. În drojdie, s–a raportat că PDC există doar ca tetramer în intervalul de pH 5,5-6.5, ca tetrameri și dimeri la valori de pH până la 9,5 și dimeri numai la pH > 9,5 (Pohl, 1997). Cu toate acestea, Hohmann (1997) a raportat existența PDC numai sub formă de dimeri la un pH de 8,4. S-a constatat că PDC de la Z. mobilis există doar sub formă de tetrameri (Pohl, 1997). În timp ce subunitățile PDC se credea anterior că au compoziții diferite, acum se știe că sunt identice (Hohmann, 1997).un total de șase gene PDC au fost identificate în Saccharomyces cerevisiae, dintre care trei sunt gene structurale (PDC1, PDC5 și PDC6), iar celelalte trei sunt considerate a fi gene legate de expresia PDC (PDC2, PDC3, PDC4) (Flikweert și colab., 1996; Hohmann, 1997; Pohl, 1997; ter Schure și colab., 1998). O singură genă structurală care codifică PDC a fost identificată în Z. mobilis (Pohl, 1997). În timp ce majoritatea lucrărilor din acest domeniu par să fi fost efectuate pe S. cerevisiae, genele pentru PDC au fost identificate într-un număr de specii de drojdie, fără a include Candida utilis. Flikweert și colegii săi au întreprins studii pentru a evalua rolul fiecăreia dintre izoenzime în activitatea generală a PDC și au constatat că expresia fiecăreia dintre izoenzimele din S. cerevisiae diferă. Folosind culturi de loturi fie cu etanol, fie cu glucoză ca substrat de carbon, PDC1 a fost exprimat constitutiv, în timp ce PDC5 a fost indus în prezența glucozei. PDC6 a fost prezent la niveluri nesemnificative. Aceste constatări au fost reluate într-o revizuire a decarboxilazelor piruvate de către Hohmann (1997), care a indicat că doar PDC1 și PDC5 au jucat un rol aparent în catabolismul zahărului, 80-90% și 10-20% din activitatea totală a PDC fiind atribuită acestor două gene, respectiv, pentru biomasa cultivată cu glucoză.

în plus față de producția de acetoină, S. cerevisiae PDC s-a dovedit a fi implicat în producția de uleiuri de fusel, care sunt compuși aromatici prezenți în băuturile alcoolice și pâine. Uleiurile de Fusel sunt produse prin decarboxilarea 2-oxoacizilor cu catenă ramificată, derivați din aminoacizi aromatici. Produsele sunt apoi dehidrogenate de alcool dehidrogenază (ADH). Activitatea PDC cu 2-oxoacizii este semnificativ mai mică decât pentru piruvat (ter Schure și colab., 1998). Producția de analogi noi de aldehidă este discutată mai târziu în acest capitol.

activitatea PDC poate fi indusă și manipulată atât prin gradul de aerare furnizat culturii, cât și prin alegerea substratului carbohidrat din mediu. Activitatea PDC este necesară pentru a permite fluxul glicolitic numai în condiții anaerobe; prin urmare, o reducere a aerării ar trebui să conducă la inducerea PDC. Atât Sims, cât și colegii (1991) și Rogers și colab. (1997) au demonstrat că o creștere a activității C. utilis PDC apare atunci când concentrația de oxigen este redusă. Un astfel de răspuns este extrem de benefic pentru producerea de l-PAC. Cu toate acestea, ambele grupuri de cercetători au descoperit că activitatea ADH, responsabilă de generarea de subproduse nedorite, o depășește pe cea a PDC în condiții anaerobe sau parțial anaerobe. Efectul condițiilor de aerare asupra fiziologiei drojdiei este discutat mai târziu în acest capitol.inducerea activității PDC de către sursa de carbohidrați depinde de speciile de drojdii implicate și de sursa de carbohidrați furnizată. Glucoza este un substrat capabil să inducă enzime glicolitice, în special PDC. Un număr de lucrători au demonstrat că adăugarea de glucoză în culturi are ca rezultat o creștere a nivelului activității PDC. Maitra și Lobo (1971) au constatat că adăugarea de glucoză ca puls la Saccharomyces spp. culturile au dus la o creștere a producției de enzime glicolitice, inclusiv PDC, după o perioadă scurtă de întârziere. Mediul utilizat pentru creștere a fost fără carbohidrați și acetat a fost utilizat ca sursă de carbon. În mod similar, Schmitt și Zimmerman (1982) au demonstrat o creștere de 18 ori a activității PDC a S. cerevisiae după adăugarea glucozei într-o cultură de balon de agitare cultivată pe etanol ca sursă unică de carbohidrați. Aceste rezultate sunt în acord cu cele ale lui Harrison (1972) și Sims și colab. (1991). Sims și colegii au demonstrat, de asemenea, natura reversibilă a activării PDC. Ei au arătat că, în condiții anaerobe, atunci când este lipsit de glucoză (prin centrifugare și omogenizare a biomasei în mediu fără glucoză), activitatea PDC A C. utilis a fost redusă cu 50%. Activitatea PDC a fost restabilită prin adăugarea de glucoză în mediu în condiții anaerobe; cu toate acestea, dacă Cultura a fost aerată în plus față de suplimentarea cu glucoză, nu a existat nicio modificare a activității PDC. O astfel de activare enzimatică nu are loc pentru toate tipurile de carbohidrați. Când speciile de drojdie sunt cultivate anaerob pe glicozide care dau efectul Kluyver, activitatea PDC este redusă în comparație cu glicozidele, cum ar fi glucoza, care poate fi metabolizată anaerob (Sims și Barnett, 1991). Ca urmare a cercetărilor lor, au descoperit că activitatea PDC poate limita rata în condiții anaerobe. Această constatare este în acord cu cea a lui van Urk și colab. (1989).

PDC este o enzimă activată de substrat-piruvat (Hubner și colab., 1978; Hohmann, 1997), care este, de asemenea, inhibat alosteric de fosfatul anorganic (Boiteux și Hess, 1970). Boiteux și Hess au raportat o creștere a Constantei Michaelis (Km) a PDC purificat de la S. carlsbergensis de la 1,3 mm în absența fosfatului anorganic la aproximativ 11 mM în prezența fosfatului de 100 mm. Efectul inhibitor a fost determinat ca fiind competitiv, variația în Km neavând niciun efect asupra activității maxime a enzimei. Sensibilitatea PDC la inhibarea de către fosfat a fost determinată a fi de același ordin de mărime ca și sensibilitatea sa la activarea de către piruvat.

Saccharomyces spp. și C. utilis sunt utilizate în mod obișnuit pentru producerea de l-PAC; cu toate acestea, la începutul muncii, s-a făcut puțin pentru a compara direct activitățile enzimatice. PDC – urile S. cerevisiae și C. utilis au fost comparate De van Dijken și Scheffers (1986) și van Urk și colab. (1989). Ei au stabilit că activitatea PDC de la S. cerevisiae a fost de aproximativ opt ori mai mare decât cea a PDC de la C. utilis, deși PDC de la prima a fost determinată a fi mai sensibilă la inhibarea de către fosfat. În ceea ce privește fosfatul, PDC de la C. utilis a prezentat valori Km similare cu cele de la S. carlsbergensis, și anume 3.6 mm în absența fosfatului și 11 mm în prezența fosfatului de 100 mm. În schimb, PDC de la S. cerevisiae a prezentat valori Km de 3,0 mm în absența fosfatului și 48 mm în prezența fosfatului de 100 mm. În consecință, disponibilitatea fosfatului joacă un rol important în activitatea PDC și, prin urmare, productivitatea PDC. O combinație de reducere a concentrației citosolice a fosfatului și a concentrațiilor crescute de piruvat a fost propusă de van Urk și colab. (1989) ca factori care contribuie la creșterea activității PDC după pulsarea Culturii cu glucoză. Procesul folosit de Oliver și colab. (1997) a implicat pulsarea cu melasă la jumătatea fermentației, prin urmare, ar fi rezultat cel mai probabil o creștere similară a activității PDC.

munca semnificativă a fost întreprinsă de Rogers și colegii de muncă (Chow și colab., 1995; Shin și Rogers, 1996a; Rogers și colab., 1997) pentru a evalua cinetica PDC de la C. utilis atât în formă purificată, cât și în celule întregi. Au înregistrat activități PDC de 0,85-0,9 u / mg proteină pentru biomasă în fază staționară întreagă după creșterea în cultura lotului. După purificarea parțială, Chow și colab. (1995) a înregistrat o creștere a activității PDC la 4,8 u/mg proteină, care a fost comparabilă cu PDC obținut comercial. Pohl (1997) sugerează că o activitate specifică în intervalul 45-60 U/mg poate fi realizată pentru PDC purificat din drojdie și plante.

Rogers și colab. (1997) a raportat o serie de parametri cinetici pentru PDC purificat de la C. utilis. Valorile Km pentru benzaldehidă și piruvat au fost de 42 mm (4% C, pH 7,0) și respectiv 2,2 mm (25% C, pH 6,0), cu concentrații mai mari de 10% piruvat necesare pentru a da condiții de saturație. Constanta de inhibare (Ki) pentru acetaldehidă a fost de aproximativ 20 mm, în timp ce inhibarea substratului a fost evidentă la concentrații de benzaldehidă mai mari de 180 mm (19,1 g/l).

Chow și colab. (1995) a întreprins studii pentru a determina cinetica dezactivării PDC de către benzaldehidă. Ei au stabilit că dezactivarea a urmat cinetica de ordinul întâi pentru benzaldehidă; cu toate acestea, răspunsul nu a fost legat liniar de timpul pentru concentrațiile de benzaldehidă cuprinse între 100 și 300 mm.

în mare parte din munca întreprinsă privind producția de l-PAC, s-a constatat că PDC nu este factorul care limitează producția de l-PAC (Vojtisek și Netrval, 1982; Shin și Rogers, 1996a; Tripathi și colab., 1997) deoarece o anumită activitate PDC a rămas la sfârșitul fermentațiilor. Mai degrabă, atât Tripathi, cât și colegii (1997) și Vojtisek și Netrval (1982) au constatat că concentrația scăzută de piruvat în randamentele medii limitate. Enzimele glicolitice au fost implicate ca potențial de limitare a ratei atât de Tripathi, cât și de colegi, și Nikolova și Ward (1991).

pe baza informațiilor de mai sus, condițiile utilizate de Oliver și colab. (1997) (a se vedea Secțiunea 4) par a fi foarte favorabile producției de l-PAC. Piruvatul este prezent în cantități semnificative și, potrivit lui Hohmann (1997), capacitatea piruvatului dehidrogenazei este limitată în comparație cu cea a PDC, restricționând astfel metabolismul piruvatului prin singura cale alternativă. Mai mult, biomasa este suplimentată cu carbohidrați în combinație cu aerarea redusă. Opera lui Sims și Barnett (1991) și Sims și colab. (1991) indică faptul că combinarea acestor două condiții conduce la inducerea PDC.