2.2 Piruvato Descarboxilasa y Suministro de Sustratos

Como se describió anteriormente, PDC es la enzima responsable de la producción de l-PAC. El PDC se encuentra generalmente como dímeros o tetrámeros, por lo que la holoenzima PDC activa generalmente existe como tetrámero, mientras que la apoenzima existe como dímero (Pohl, 1997). La existencia de las formas de dímero y tetrámero depende del pH. En la levadura, se ha informado que el PDC existe solo como tetrámero en el rango de pH 5.5-6.5, como tetrámeros y dímeros a valores de pH de hasta 9,5, y dímeros solo a pH > 9,5 (Pohl, 1997). Sin embargo, Hohmann (1997) ha informado de la existencia de PDC solo en forma de dímeros a un pH de 8,4. Se ha encontrado que el PDC de Z. mobilis solo existe en forma de tetrámeros (Pohl, 1997). Mientras que anteriormente se pensaba que las subunidades PDC tenían composiciones diferentes, ahora se sabe que son idénticas (Hohmann, 1997).

Se ha identificado un total de seis genes PDC en Saccharomyces cerevisiae, de los cuales tres son genes estructurales (PDC1, PDC5 y PDC6) y los tres restantes se consideran genes relacionados con la expresión de PDC (PDC2, PDC3, PDC4) (Flikweert et al., 1996; Hohmann, 1997; Pohl, 1997; ter Schure et al., 1998). En Z. mobilis se ha identificado un único gen estructural que codifica la PDC (Pohl, 1997). Si bien la mayor parte del trabajo en esta área parece haberse realizado en S. cerevisiae, se han identificado genes para PDC en varias especies de levaduras, sin incluir Candida utilis. Flikweert y sus colaboradores realizaron estudios para evaluar el papel de cada una de las isoenzimas en la actividad general de la CPD, y encontraron que la expresión de cada una de las isoenzimas en S. cerevisiae difería. Utilizando el cultivo por lotes con etanol o glucosa como sustrato de carbono, la PDC1 se expresó constitutivamente mientras que la PDC5 se indujo en presencia de glucosa. La PDC6 estaba presente en niveles insignificantes. Estos hallazgos se repitieron en una revisión de piruvato descarboxilasas realizada por Hohmann (1997), quien indicó que solo la PDC1 y la PDC5 desempeñaban un papel aparente en el catabolismo del azúcar, con un 80-90% y un 10-20% de la actividad total de la PDC atribuida a estos dos genes, respectivamente, para la biomasa cultivada con glucosa.

Además de la producción de acetoína, se ha encontrado que S. cerevisiae PDC participa en la producción de aceites de fusel, que son compuestos aromatizantes presentes en bebidas alcohólicas y pan. Los aceites de fusel se producen por descarboxilación de ácidos 2-oxo de cadena ramificada, derivados de aminoácidos aromáticos. Los productos son deshidrogenados por la alcohol deshidrogenasa (ADH). La actividad del PDC con los ácidos 2-oxo es significativamente menor que la del piruvato (ter Schure et al., 1998). La producción de nuevos análogos de aldehído se discute más adelante en este capítulo.

La actividad de PDC puede ser inducida y manipulada tanto por el grado de aireación suministrado al cultivo como por la elección del sustrato de carbohidratos en el medio. La actividad de la PDC es necesaria para permitir el flujo glucolítico solo en condiciones anaeróbicas; por lo tanto, una reducción en la aireación debe resultar en la inducción de la PDC. Ambos Sims y compañeros de trabajo (1991) y Rogers et al. (1997) han demostrado que se produce un aumento de la actividad de C. utilis PDC cuando se reduce la concentración de oxígeno. Tal respuesta es altamente beneficiosa para la producción de l-PAC. Sin embargo, ambos grupos de investigadores encontraron que la actividad de la ADH, responsable de la generación de subproductos no deseados, excede la de la PDC en condiciones anaeróbicas o parcialmente anaeróbicas. El efecto de las condiciones de aireación en la fisiología de la levadura se discute más adelante en este capítulo.

La inducción de la actividad de PDC por fuente de carbohidratos depende de la especie de levadura involucrada y de la fuente de carbohidratos suministrada. La glucosa es un sustrato capaz de inducir enzimas glicolíticas, especialmente PDC. Varios trabajadores han demostrado que la adición de glucosa a los cultivos resulta en un aumento en el nivel de actividad de la PDC. Maitra y Lobo (1971) encontraron que la adición de glucosa como pulso a Saccharomyces spp. los cultivos dieron lugar a un aumento en la producción de enzimas glicolíticas, incluida la PDC, después de un corto período de retraso. El medio utilizado para el crecimiento no contenía carbohidratos y se utilizó acetato como fuente de carbono. De manera similar, Schmitt y Zimmerman (1982) demostraron un aumento de 18 veces en la actividad de PDC de S. cerevisiae después de que se agregara glucosa a un cultivo de matraz de batido cultivado con etanol como única fuente de carbohidratos. Estos resultados concuerdan con los de Harrison (1972) y Sims et al. (1991). Sims y compañeros de trabajo también demostraron la naturaleza reversible de la activación de PDC. Mostraron que, en condiciones anaeróbicas, cuando se privaba de glucosa (por centrifugación y resuspensión de biomasa en medio libre de glucosa), la actividad PDC de C. utilis se reducía en un 50%. La actividad de la PDC se restableció mediante la adición de glucosa al medio en condiciones anaeróbicas; sin embargo, si el cultivo se aireó además de la suplementación de glucosa, no hubo cambio en la actividad de la PDC. Tal activación enzimática no ocurre para todos los tipos de carbohidratos. Cuando las especies de levadura se cultivan anaeróbicamente en glucósidos que dan el efecto Kluyver, la actividad de la PDC se reduce en comparación con los glucósidos, como la glucosa, que se pueden metabolizar anaeróbicamente (Sims y Barnett, 1991). Como resultado de su investigación, encontraron que la actividad de PDC puede limitar la velocidad en condiciones anaeróbicas. Este hallazgo está de acuerdo con el de van Urk et al. (1989).

El PDC es una enzima activada por sustrato piruvato (Hubner et al., 1978; Hohmann, 1997), que también es inhibida alostéricamente por el fosfato inorgánico (Boiteux y Hess, 1970). Boiteux y Hess informaron un aumento en la constante de Michaelis (km) de PDC purificado de S. carlsbergensis de 1,3 mm en ausencia de fosfato inorgánico a aproximadamente 11 mm en presencia de fosfato de 100 mm. Se determinó que el efecto inhibitorio era de naturaleza competitiva, ya que la variación de Km no tenía ningún efecto sobre la actividad máxima de la enzima. Se determinó que la sensibilidad del PDC a la inhibición por fosfato era del mismo orden de magnitud que su sensibilidad a la activación por piruvato.

Saccharomyces spp. y C. utilis se utilizan comúnmente para la producción de l-PAC; sin embargo, en los primeros trabajos, se hizo poco para comparar directamente las actividades enzimáticas. Los CPD de S. cerevisiae y C. utilis fueron comparados por van Dijken y Scheffers (1986), y van Urk et al. (1989). Determinaron que la actividad de la PDC de S. cerevisiae era aproximadamente ocho veces mayor que la de la PDC de C. utilis, aunque se determinó que la PDC de la primera era más sensible a la inhibición por el fosfato. Con respecto al fosfato, el PDC de C. utilis mostró valores de Km similares a los de S. carlsbergensis, a saber, 3.6 mm en ausencia de fosfato, y 11 mm en presencia de fosfato de 100 mm. En contraste, el PDC de S. cerevisiae mostró valores de Km de 3,0 mm en ausencia de fosfato y de 48 mm en presencia de fosfato de 100 mm. En consecuencia, la disponibilidad de fosfato juega un papel importante en la actividad de la PDC y, por lo tanto, en la productividad de la PDC. Van Urk et al.propusieron una combinación de reducción de la concentración citosólica de fosfato y aumento de las concentraciones de piruvato. (1989) como factores que contribuyen al aumento de la actividad de la PDC después de pulsar el cultivo con glucosa. El proceso utilizado por Oliver et al. (1997) involucró pulsaciones con melaza a mitad de la fermentación, por lo tanto, un aumento similar en la actividad de PDC probablemente habría resultado.

Rogers y sus compañeros de trabajo han realizado un trabajo significativo (Chow et al., 1995; Shin y Rogers, 1996a; Rogers et al., 1997) para evaluar la cinética del PDC de C. utilis tanto en forma purificada como en células enteras. Registraron actividades de PDC de 0,85-0,9 U/mg de proteína para biomasa entera en fase estacionaria después del crecimiento en cultivo por lotes. Después de la purificación parcial, Chow et al. (1995) registraron un aumento de la actividad de la PDC a 4,8 U / mg de proteína, que era comparable con la PDC obtenida comercialmente. Pohl (1997) sugiere que se puede lograr una actividad específica en el rango de 45-60 U/mg para el PDC purificado a partir de levaduras y plantas.

Rogers et al. (1997) informaron de una serie de parámetros cinéticos para el PDC purificado de C. utilis. Los valores de km para el benzaldehído y el piruvato fueron de 42 mm (4 °C, pH 7,0) y 2,2 mm (25 °C, pH 6,0) respectivamente, con concentraciones superiores a 10 mm de piruvato necesarias para dar condiciones de saturación. La constante de inhibición (Ki) para el acetaldehído fue de aproximadamente 20 mm, mientras que la inhibición del sustrato fue evidente a concentraciones de benzaldehído superiores a 180 mm (19,1 g/l).

Chow et al. (1995) realizaron estudios para determinar la cinética de desactivación de PDC por benzaldehído. Determinaron que la desactivación seguía una cinética de primer orden para el benzaldehído; sin embargo, la respuesta no se relacionó linealmente con el tiempo para concentraciones de benzaldehído entre 100 y 300 mm.

En gran parte del trabajo realizado en la producción de l-PAC, se ha encontrado que el PDC no es el factor que limita la producción de l-PAC (Vojtisek y Netrval, 1982; Shin y Rogers, 1996a; Tripathi et al., 1997) ya que parte de la actividad de PDC se mantuvo al final de las fermentaciones. Más bien, tanto Tripathi y colaboradores (1997) como Vojtisek y Netrval (1982) encontraron que la baja concentración de piruvato en el rendimiento medio era limitada. Las enzimas glicolíticas fueron implicadas como potencialmente limitantes de velocidad tanto por Tripathi y compañeros de trabajo, como por Nikolova y Ward (1991).

En base a la información anterior, las condiciones utilizadas por Oliver et al. (1997) (véase la sección 4) parecen ser muy propicias para la producción de l-PAC. El piruvato está presente en cantidades significativas y, según Hohmann (1997), la capacidad de la piruvato deshidrogenasa es limitada en comparación con la de la PDC, restringiendo así el metabolismo del piruvato a través de la única ruta alternativa. Además, la biomasa se complementa con carbohidratos en combinación con una aireación reducida. El trabajo de Sims y Barnett (1991) y Sims et al. (1991) indica que la combinación de estas dos condiciones es propicia para la inducción de PDC.