2.2 Piruvato decarbossilasi e fornitura di substrati

Come descritto sopra, PDC è l’enzima responsabile della produzione di l-PAC. PDC è trovato solitamente per esistere come dimeri o tetrameri per cui l’oloenzima attivo di PDC esiste generalmente come tetramero, mentre l’apoenzima esiste come dimero (Pohl, 1997). L’esistenza delle forme dimero e tetramero dipende dal pH. Nel lievito, PDC è stato segnalato per esistere soltanto come tetramero nella gamma di pH 5,5–6.5, come tetrameri e dimeri a valori di pH fino a 9,5, e dimeri solo a pH > 9,5 (Pohl, 1997). Tuttavia, Hohmann (1997) ha riportato l’esistenza di PDC solo sotto forma di dimeri a un pH di 8,4. PDC da Z. mobilis è stato trovato per esistere solo sotto forma di tetrameri (Pohl, 1997). Mentre in precedenza si pensava che le subunità PDC avessero composizioni diverse, ora sono note per essere identiche (Hohmann, 1997).

Un totale di sei geni PDC è stato identificato in Saccharomyces cerevisiae, di cui tre sono geni strutturali (PDC1, PDC5 e PDC6) e i restanti tre sono considerati geni correlati all’espressione di PDC (PDC2, PDC3, PDC4) (Flikweert et al., 1996; Hohmann, 1997; Pohl, 1997; ter Schure et al., 1998). Un singolo gene strutturale che codifica per PDC è stato identificato in Z. mobilis (Pohl, 1997). Mentre la maggior parte del lavoro in quest’area sembra essere stata eseguita su S. cerevisiae, i geni per la PDC sono stati identificati in un certo numero di specie di lieviti, esclusa la Candida utilis. Flikweert e collaboratori hanno intrapreso studi per valutare il ruolo di ciascuno degli isoenzimi nell’attività complessiva della PDC e hanno scoperto che l’espressione di ciascuno degli isoenzimi in S. cerevisiae differiva. Utilizzando colture batch con etanolo o glucosio come substrato di carbonio, PDC1 è stato espresso in modo costitutivo mentre PDC5 è stato indotto in presenza di glucosio. PDC6 era presente a livelli insignificanti. Questi risultati sono stati ripresi in una revisione sulle decarbossilasi piruvato da Hohmann (1997), che ha indicato che solo PDC1 e PDC5 hanno svolto un ruolo apparente nel catabolismo dello zucchero, con l ‘ 80-90% e il 10-20% dell’attività totale della PDC attribuita a questi due geni, rispettivamente, per la biomassa coltivata a glucosio.

Oltre alla produzione di acetoina, S. cerevisiae PDC è stato trovato coinvolto nella produzione di oli fusel, che sono composti aromatici presenti nelle bevande alcoliche e nel pane. Gli oli fusel sono prodotti dalla decarbossilazione di acidi 2-osso a catena ramificata, derivati da amminoacidi aromatici. I prodotti vengono quindi deidrogenati dall’alcol deidrogenasi (ADH). L’attività del PDC con gli acidi 2-osso è significativamente inferiore rispetto al piruvato (ter Schure et al., 1998). La produzione di nuovi analoghi aldeidici è discussa più avanti in questo capitolo.

L’attività del PDC può essere indotta e manipolata sia dal grado di aerazione fornito alla coltura che dalla scelta del substrato di carboidrati nel mezzo. L’attività della PDC è necessaria per consentire il flusso glicolitico solo in condizioni anaerobiche; pertanto, una riduzione dell’aerazione dovrebbe comportare l’induzione della PDC. Sia Sims e collaboratori (1991) e Rogers et al. (1997) hanno dimostrato che un aumento dell’attività di C. utilis PDC si verifica quando la concentrazione di ossigeno è ridotta. Tale risposta è altamente vantaggiosa per la produzione di l-PAC. Tuttavia, entrambi i gruppi di ricercatori hanno scoperto che l’attività dell’ADH, responsabile della generazione di sottoprodotti indesiderati, supera quella della PDC in condizioni anaerobiche o parzialmente anaerobiche. L’effetto delle condizioni di aerazione sulla fisiologia del lievito è discusso più avanti in questo capitolo.

L’induzione dell’attività della PDC per fonte di carboidrati dipende dalle specie di lievito coinvolte e dalla fonte di carboidrati fornita. Il glucosio è un substrato in grado di indurre enzimi glicolitici, in particolare PDC. Un certo numero di lavoratori ha dimostrato che l’aggiunta di glucosio alle colture comporta un aumento del livello di attività della PDC. Maitra e Lobo (1971) hanno scoperto che l’aggiunta di glucosio come impulso a Saccharomyces spp. le colture hanno determinato un aumento della produzione di enzimi glicolitici, inclusa la PDC, dopo un breve periodo di ritardo. Il mezzo utilizzato per la crescita era privo di carboidrati e l’acetato è stato utilizzato come fonte di carbonio. Allo stesso modo, Schmitt e Zimmerman (1982) hanno dimostrato un aumento di 18 volte dell’attività PDC di S. cerevisiae dopo che il glucosio è stato aggiunto a una coltura di shake flask coltivata su etanolo come unica fonte di carboidrati. Questi risultati sono in accordo con quelli di Harrison (1972) e Sims et al. (1991). Sims e collaboratori hanno anche dimostrato la natura reversibile dell’attivazione del PDC. Hanno dimostrato che, in condizioni anaerobiche, quando privato di glucosio (centrifugando e risospendendo la biomassa in mezzo privo di glucosio) l’attività PDC di C. utilis è stata ridotta del 50%. L’attività della PDC è stata ripristinata con l’aggiunta di glucosio al mezzo in condizioni anaerobiche; tuttavia, se la coltura è stata aerata in aggiunta alla supplementazione di glucosio, non vi è stato alcun cambiamento nell’attività della PDC. Tale attivazione enzimatica non si verifica per tutti i tipi di carboidrati. Quando le specie di lievito vengono coltivate anaerobicamente su glicosidi che danno l’effetto Kluyver, l’attività del PDC è ridotta rispetto ai glicosidi, come il glucosio, che può essere metabolizzato anaerobicamente (Sims e Barnett, 1991). Come risultato della loro ricerca, hanno scoperto che l’attività PDC può essere limitante in condizioni anaerobiche. Questa scoperta è in accordo con quella di van Urk et al. (1989).

La PDC è un enzima attivato dal substrato-piruvato (Hubner et al., 1978; Hohmann, 1997), che è anche inibito allostericamente dal fosfato inorganico (Boiteux e Hess, 1970). Boiteux e Hess hanno riportato un aumento della costante di Michaelis (Km) di PDC purificato da S. carlsbergensis da 1,3 mm in assenza di fosfato inorganico a circa 11 mm in presenza di fosfato da 100 mm. L’effetto inibitorio è stato determinato per essere competitivo in natura, la variazione in Km non ha alcun effetto sulla massima attività dell’enzima. La sensibilità della PDC all’inibizione da parte del fosfato è stata determinata essere dello stesso ordine di grandezza della sua sensibilità all’attivazione da parte del piruvato.

Saccharomyces spp. e C. utilis sono comunemente usati per la produzione di l-PAC; tuttavia, nei primi lavori, poco è stato fatto per confrontare direttamente le attività enzimatiche. I PDC di S. cerevisiae e C. utilis sono stati confrontati da van Dijken e Scheffers (1986) e van Urk et al. (1989). Hanno determinato che l’attività della PDC di S. cerevisiae era circa otto volte quella della PDC di C. utilis, sebbene la PDC della prima fosse determinata essere più sensibile all’inibizione da parte del fosfato. Per quanto riguarda il fosfato, il PDC di C. utilis ha mostrato valori Km simili a quelli di S. carlsbergensis, vale a dire 3.6 mm in assenza di fosfato e 11 mm in presenza di fosfato da 100 mm. Al contrario, la PDC di S. cerevisiae ha mostrato valori Km di 3,0 mm in assenza di fosfato e 48 mm in presenza di fosfato da 100 mm. Di conseguenza, la disponibilità di fosfato svolge un ruolo importante nell’attività del PDC e quindi nella produttività del PDC. Una combinazione di riduzione della concentrazione citosolica di fosfato e aumento delle concentrazioni di piruvato è stata proposta da van Urk et al. (1989) come fattori che contribuiscono all’aumento dell’attività della PDC dopo aver pulsato la coltura con glucosio. Il processo utilizzato da Oliver et al. (1997) ha coinvolto pulsare con melassa a metà della fermentazione, quindi un simile aumento dell’attività PDC molto probabilmente avrebbe portato.

Un lavoro significativo è stato intrapreso da Rogers e colleghi (Chow et al., 1995; Shin e Rogers, 1996a; Rogers et al., 1997) per valutare la cinetica della PDC da C. utilis sia in forma purificata che in cellule intere. Hanno registrato attività PDC di 0,85-0,9 U/mg di proteine per biomassa intera in fase stazionaria dopo la crescita in coltura batch. Dopo la purificazione parziale, Chow et al. (1995) ha registrato un aumento dell’attività della PDC a 4,8 U/mg di proteine, che era paragonabile alla PDC ottenuta commercialmente. Pohl (1997) suggerisce che un’attività specifica nell’intervallo di 45-60 U/mg può essere raggiunta per PDC purificato da lievito e piante.

Rogers et al. (1997) ha riportato una serie di parametri cinetici per PDC purificato da C. utilis. I valori Km per benzaldeide e piruvato erano rispettivamente di 42 mm (4 °C, pH 7,0) e 2,2 mm (25 °C, pH 6,0), con concentrazioni superiori a 10 mm di piruvato necessarie per dare condizioni di saturazione. La costante di inibizione (Ki) per l’acetaldeide era di circa 20 mm, mentre l’inibizione del substrato era evidente a concentrazioni di benzaldeide superiori a 180 mm (19,1 g/l).

Chow et al. (1995) ha intrapreso studi per determinare la cinetica della disattivazione della PDC da parte della benzaldeide. Hanno determinato che la disattivazione seguiva la cinetica del primo ordine per la benzaldeide; tuttavia, la risposta non era linearmente correlata al tempo per le concentrazioni di benzaldeide tra 100 e 300 mm.

In gran parte del lavoro intrapreso sulla produzione di l-PAC, è stato trovato che il PDC non è il fattore che limita la produzione di l-PAC (Vojtisek e Netrval, 1982; Shin e Rogers, 1996a; Tripathi et al., 1997) poiché alcune attività di PDC sono rimaste alla fine delle fermentazioni. Piuttosto, sia Tripathi che i colleghi (1997) e Vojtisek e Netrval (1982) hanno scoperto che la bassa concentrazione di piruvato nelle rese medie limitate. Gli enzimi glicolitici sono stati implicati come potenzialmente limitanti da Tripathi e colleghi, e Nikolova e Ward (1991).

Sulla base delle informazioni di cui sopra, le condizioni utilizzate da Oliver et al. (1997) (vedi Sezione 4) sembrano essere molto favorevoli alla produzione di l-PAC. Il piruvato è presente in quantità significative e, secondo Hohmann (1997), la capacità della piruvato deidrogenasi è limitata rispetto a quella della PDC, limitando così il metabolismo del piruvato attraverso l’unica via alternativa. Inoltre, la biomassa è integrata con carboidrati in combinazione con aerazione ridotta. Il lavoro di Sims e Barnett (1991) e Sims et al. (1991) indica che la combinazione di queste due condizioni favorisce l’induzione della PDC.