2.2 Pyruvatdekarboksylase og Tilførsel av Substrater

SOM beskrevet ovenfor ER PDC enzymet som er ansvarlig for produksjonen av l-PAC. PDC er vanligvis funnet å eksistere som enten dimerer eller tetramere hvor det aktive PDC-holoenzymet generelt eksisterer som en tetramer, mens apoenzymet eksisterer som en dimer (Pohl, 1997). Eksistensen av dimer-og tetramerformene er ph-avhengig. I gjær HAR PDC blitt rapportert å eksistere bare som en tetramer i pH-området 5.5-6.5, som både tetramere og dimere ved pH-verdier opp til 9,5, og dimere bare ved pH > 9,5 (Pohl, 1997). Imidlertid Har Hohmann (1997) rapportert EKSISTENSEN AV PDC bare i form av dimerer ved en pH på 8,4. PDC fra Z. mobilis har vist seg å eksistere bare i form av tetramere (Pohl, 1997). MENS PDC-underenheter tidligere ble antatt å ha forskjellige komposisjoner, er de nå kjent for å være identiske (Hohmann, 1997).Totalt seks PDC-gener er identifisert I Saccharomyces cerevisiae, hvorav tre er strukturelle gener (PDC1, PDC5 OG PDC6) og de resterende tre anses å være gener relatert til EKSPRESJON AV PDC (PDC2, PDC3, PDC4) (Flikweert et al., 1996; Hohmann, 1997; Pohl, 1997; ter Schure et al., 1998). Et enkelt strukturelt gen som koder FOR PDC har blitt identifisert I Z. mobilis (Pohl, 1997). Mens flertallet av arbeidet på dette området ser ut til å ha blitt utført På S. cerevisiae, har GENER FOR PDC blitt identifisert i en rekke gjærarter, ikke Inkludert Candida utilis. Flikweert og medarbeidere foretok studier for å vurdere rollen til hvert av isoenzymene i samlet PDC-aktivitet, og fant at uttrykket for hvert av isoenzymene i s. cerevisiae var forskjellig. VED bruk av batchkultur med enten etanol eller glukose som karbonsubstrat ble PDC1 uttrykt konstitutivt mens PDC5 ble indusert i nærvær av glukose. PDC6 var tilstede på ubetydelige nivåer. Disse funnene ble gjentatt i En gjennomgang av pyruvatdekarboksylaser Av Hohmann (1997), som indikerte at BARE PDC1 og PDC5 spilte en tydelig rolle i sukkerkatabolisme, med 80-90% og 10-20% av total PDC-aktivitet som tilskrives disse to genene, henholdsvis for glukosedyrket biomasse.

I tillegg til produksjonen av acetoin, har s. cerevisiae PDC vist seg å være involvert i produksjon av fuseloljer, som er smaksforbindelser som finnes i alkoholholdige drikker og brød. Fuseloljer produseres ved dekarboksylering av forgrenede 2-oksosyrer, avledet fra aromatiske aminosyrer. Produktene blir deretter dehydrogenert av alkoholdehydrogenase (ADH). AKTIVITETEN TIL PDC med 2-oksosyrene er betydelig lavere enn for pyruvat (ter Schure et al., 1998). Produksjon av nye aldehydanaloger diskuteres senere i dette kapitlet.PDC-aktivitet kan induseres og manipuleres både av graden av lufting som tilføres kulturen og ved valg av karbohydratsubstrat i mediet. PDC-aktivitet er nødvendig for å muliggjøre glykolytisk flux bare under anaerobe forhold; derfor bør en reduksjon i lufting resultere i induksjon av PDC. Både Sims og kolleger (1991) Og Rogers et al. (1997) har vist at en økning I C. utilis PDC-aktivitet oppstår når oksygenkonsentrasjonen reduseres. Et slikt svar er svært gunstig for produksjonen av l-PAC. Imidlertid fant begge grupper av forskere at AKTIVITETEN TIL ADH, som er ansvarlig for generering av uønskede biprodukter, overstiger PDC under anaerobe eller delvis anaerobe forhold. Effekten av luftingsforhold på gjærfysiologi diskuteres senere i dette kapitlet.

Induksjon AV PDC-aktivitet etter karbohydratkilde er avhengig av gjærartene som er involvert og karbohydratkilden som leveres. Glukose er et substrat som er i stand til å indusere glykolytiske enzymer, spesielt PDC. En rekke arbeidere har vist at tilsetning av glukose til kulturer resulterer i en økning i NIVÅET AV PDC-aktivitet. Maitra Og Lobo (1971) fant at tilsetningen av glukose som en puls Til Saccharomyces spp. kulturer resulterte i en økning i produksjonen av glykolytiske enzymer, inkludert PDC, etter en kort forsinkelsesperiode. Mediet som ble brukt til vekst var karbohydratfritt og acetat ble brukt som karbonkilde. På samme måte viste Schmitt og Zimmerman (1982) en 18-ganger økning i PDC-aktiviteten Til s. cerevisiae etter at glukose ble tilsatt til en shake kolbe-kultur dyrket på etanol som eneste karbohydratkilde. Disse resultatene er i samsvar Med De Av Harrison (1972) Og Sims et al. (1991). Sims og medarbeidere viste også reversibel NATUR PDC aktivering. De viste at, under anaerobe forhold, når fratatt glukose (ved sentrifugering og resuspending biomasse i glukosefritt medium) PDC aktivitet Av c. utilis ble redusert med 50%. PDC-aktivitet ble gjenopprettet ved tilsetning av glukose til mediet under anaerobe forhold; men hvis kulturen ble luftet i tillegg til glukosetilskudd, var DET ingen endring i PDC-aktivitet. Slike enzymaktivering forekommer ikke for alle karbohydrattyper. NÅR gjærarter dyrkes anaerobt på glykosider som gir Kluyver-effekten, REDUSERES PDC-aktiviteten sammenlignet med glykosider, som glukose, som kan metaboliseres anaerobt (Sims Og Barnett, 1991). SOM et resultat av deres forskning fant de AT PDC-aktivitet kan være hastighetsbegrensende i anaerobe forhold. Dette funnet er i samsvar med van Urk et al. (1989).PDC ER et substrat-pyruvataktivert enzym (Hubner et al., 1978; Hohmann, 1997), som også allosterisk hemmes av uorganisk fosfat (Boiteux og Hess, 1970). Boiteux og Hess rapporterte en økning I Michaelis-konstanten (Km) av renset PDC fra S. carlsbergensis fra 1.3 mm i fravær av uorganisk fosfat til omtrent 11 mM i nærvær av 100 mm fosfat. Den hemmende effekten ble bestemt å være konkurransedyktig i naturen, variasjonen I Km hadde ingen effekt på enzymets maksimale aktivitet. PDCS følsomhet overfor fosfathemming ble bestemt å være av samme størrelsesorden som dens følsomhet overfor pyruvataktivering.

Saccharomyces spp. og c. utilis brukes ofte til produksjon av l-PAC; men i tidlig arbeid ble lite gjort for å sammenligne enzymaktiviteter direkte. Pdc-ene Til s. cerevisiae og C. utilis ble sammenlignet av van Dijken Og Scheffers (1986), og van Urk et al. (1989). De bestemte at AKTIVITETEN TIL PDC fra s. cerevisiae var omtrent åtte ganger DEN FOR PDC Fra C. utilis, selv OM PDC fra den tidligere var fast bestemt på å være mer følsom for inhibering av fosfat. MED hensyn til fosfat, PDC Fra C. utilis vises lignende Km verdier som fra S. carlsbergensis, nemlig 3.6 mm i fravær av fosfat, og 11 mm i nærvær av 100 mm fosfat. I kontrast viste PDC Fra s. cerevisiae Km-verdier på 3,0 mm i fravær av fosfat og 48 mm i nærvær av 100 mm fosfat. Følgelig spiller tilgjengeligheten av fosfat en viktig rolle I AKTIVITETEN TIL PDC og DERMED PDC produktivitet. En kombinasjon av reduksjon i cytosolisk konsentrasjon av fosfat og økte pyruvatkonsentrasjoner ble foreslått av van Urk et al. (1989) som medvirkende faktorer til økt PDC-aktivitet etter pulserende kultur med glukose. Prosessen som Brukes Av Oliver et al. (1997) involvert pulserende med melasse midtveis gjennom gjæringen, derfor ville en lignende økning i PDC-aktivitet trolig ha resultert.

Betydelig arbeid har blitt utført Av Rogers og medarbeidere (Chow et al., 1995; Shin Og Rogers, 1996a; Rogers et al.(1997) for å evaluere KINETIKKEN TIL PDC fra C. utilis i både renset form og i hele celler. DE registrerte PDC-aktiviteter på 0.85-0.9 U / mg protein for hel, stasjonær fase biomasse etter vekst i batchkultur. Etter delvis rensing, Chow et al. (1995) registrert en økning I PDC-aktivitet til 4.8 U / mg protein, som var sammenlignbar med kommersielt oppnådd PDC. Pohl (1997) antyder at en spesifikk aktivitet i området 45-60 U / mg kan oppnås FOR PDC renset fra gjær og planter.

Rogers et al. (1997) rapporterte en rekke kinetiske parametere for renset PDC Fra C. utilis. Km-verdiene for benzaldehyd og pyruvat var henholdsvis 42 mm (4 °C, pH 7,0) og 2,2 mm (25 °c, pH 6,0), med konsentrasjoner over 10 mm pyruvat som kreves for å gi mettingsforhold. Inhiberingskonstanten (ki) for acetaldehyd var omtrent 20 mm, mens substrathemming var tydelig ved benzaldehydkonsentrasjoner over 180 mm (19,1 g/l).

Chow et al. (1995) foretok studier for å bestemme kinetikken for deaktivering AV PDC av benzaldehyd. De bestemte at deaktiveringen fulgte førstegangs kinetikk for benzaldehyd; responsen var imidlertid ikke lineært relatert til tiden for benzaldehydkonsentrasjoner mellom 100 og 300 mm.I mye av arbeidet med produksjon av l-PAC HAR PDC vist seg å ikke være den faktor-begrensende l-PAC-produksjonen (Vojtisek Og Netrval, 1982; Shin og Rogers, 1996a; Tripathi et al., 1997) siden NOEN PDC aktivitet forble på slutten av fermentations. Snarere fant Både Tripathi og medarbeidere (1997) Og Vojtisek og Netrval (1982) at lav pyruvatkonsentrasjon i middels begrensede utbytter. Glykolytiske enzymer ble implisert som potensielt hastighetsbegrensende av Både Tripathi og medarbeidere, Og Nikolova og Ward (1991).

Basert på informasjonen ovenfor, Vilkårene Som Brukes Av Oliver et al. (1997) (Se Avsnitt 4) synes å være svært bidrar til produksjon av l-PAC. Pyruvat er tilstede i betydelige mengder, Og Ifølge Hohmann (1997) er kapasiteten til pyruvat dehydrogenase begrenset sammenlignet med PDC, og begrenser dermed metabolismen av pyruvat via den eneste alternative ruten. Videre er biomassen supplert med karbohydrat i kombinasjon med redusert lufting. The work Of Sims Og Barnett (1991) Og Sims et al. (1991) indikerer at kombinasjonen av disse to forholdene bidrar til induksjon AV PDC.