2.2 pyruvaat Decarboxylase en levering van substraten

zoals hierboven beschreven, is PDC het enzym dat verantwoordelijk is voor de productie van l-PAC. PDC wordt meestal gevonden te bestaan als dimeren of tetrameren, waarbij het actieve PDC holoenzym bestaat over het algemeen als een tetramer, terwijl het apoenzym bestaat als een dimeer (Pohl, 1997). Het bestaan van de dimeer-en tetrameervormen is pH-afhankelijk. In gist is gemeld dat PDC alleen bestaat als een tetrameer in het pH-bereik 5,5-6.5, als zowel tetrameren als dimeren bij pH-waarden tot 9,5, en dimeren alleen bij pH > 9,5 (Pohl, 1997). Hohmann (1997) heeft echter het bestaan van PDC alleen gemeld in de vorm van dimeren bij een pH van 8,4. PDC uit Z. mobilis blijkt alleen in de vorm van tetramers te bestaan (Pohl, 1997). Hoewel men vroeger dacht dat PDC-subeenheden verschillende composities hadden, is nu bekend dat ze identiek zijn (Hohmann, 1997).

in totaal zijn zes PDC-genen geïdentificeerd in Saccharomyces cerevisiae, waarvan drie structurele genen zijn (PDC1, PDC5 en PDC6) en de overige drie worden beschouwd als genen gerelateerd aan de expressie van PDC (Pdc2, Pdc3, PDC4) (Flikweert et al., 1996; Hohmann, 1997; Pohl, 1997; ter Schure et al., 1998). In Z. mobilis (Pohl, 1997) is één enkele structurele gencodering voor PDC geïdentificeerd. Hoewel het grootste deel van het werk op dit gebied lijkt te zijn uitgevoerd op S. cerevisiae, zijn genen voor PDC geïdentificeerd in een aantal gistsoorten, met uitzondering van Candida utilis. Flikweert en collega ‘ s ondernamen studies om de rol van elk van de iso-enzymen in de totale PDC-activiteit te beoordelen, en vonden dat de expressie van elk van de iso-enzymen in S. cerevisiae verschilde. Gebruikmakend van batchcultuur met ethanol of glucose als koolstofsubstraat, werd pdc1 constitutief uitgedrukt terwijl PDC5 werd geïnduceerd in aanwezigheid van glucose. PDC6 was op onbeduidende niveaus aanwezig. Deze bevindingen werden bevestigd in een review over pyruvaat decarboxylases door Hohmann (1997), die erop wees dat alleen PDC1 en PDC5 een duidelijke rol speelden in suikerkatabolisme, waarbij 80-90% en 10-20% van de totale PDC-activiteit werd toegeschreven aan deze twee genen, respectievelijk, voor glucose-gekweekte biomassa.

naast de productie van acetoïne is gebleken dat S. cerevisiae PDC betrokken is bij de productie van foezeloliën, smaakstoffen die aanwezig zijn in alcoholische dranken en brood. Foezeloliën worden geproduceerd door de decarboxylatie van vertakte keten2-oxozuren, afgeleid van aromatische aminozuren. De producten worden vervolgens gedehydrogeneerd door alcoholdehydrogenase (ADH). De activiteit van PDC met de 2-oxozuren is significant lager dan die van pyruvaat (ter Schure et al., 1998). De productie van nieuwe aldehyde-analogen wordt later in dit hoofdstuk besproken.

PDC-activiteit kan worden geïnduceerd en gemanipuleerd door zowel de mate van beluchting in de kweek als door de keuze van het koolhydraatsubstraat in het medium. PDC-activiteit is alleen vereist om glycolytische flux mogelijk te maken onder anaërobe omstandigheden; daarom moet een vermindering van de beluchting resulteren in de inductie van PDC. Zowel Sims en medewerkers (1991) en Rogers et al. (1997) hebben aangetoond dat een toename van de activiteit van C. utilis PDC optreedt wanneer de zuurstofconcentratie wordt verlaagd. Een dergelijke reactie is zeer gunstig voor de productie van l-PAC. Beide groepen onderzoekers vonden echter dat de activiteit van ADH, verantwoordelijk voor het genereren van ongewenste bijproducten, hoger is dan die van PDC onder anaërobe of gedeeltelijk anaërobe omstandigheden. Het effect van beluchting op de gistfysiologie wordt later in dit hoofdstuk besproken.

inductie van PDC-activiteit door koolhydraatbron is afhankelijk van de betrokken gistsoorten en de geleverde koolhydraatbron. Glucose is een substraat dat glycolytische enzymen kan induceren, vooral PDC. Een aantal werknemers heeft aangetoond dat de toevoeging van glucose aan culturen leidt tot een toename van de PDC-activiteit. Maitra en Lobo (1971) vonden dat de toevoeging van glucose als puls aan Saccharomyces spp. culturen resulteerden in een toename van de productie van glycolytische enzymen, waaronder PDC, na een korte vertraging periode. Het medium dat Voor de groei werd gebruikt was koolhydraatvrij en acetaat werd gebruikt als koolstofbron. Ook Schmitt en Zimmerman (1982) vertoonden een 18-voudige toename van de PDC-activiteit van S. cerevisiae nadat glucose werd toegevoegd aan een schudkolf cultuur gekweekt op ethanol als enige koolhydraatbron. Deze resultaten zijn in overeenstemming met die van Harrison (1972) en Sims et al. (1991). Sims en medewerkers toonden ook de omkeerbare aard van PDC-activering aan. Zij toonden aan dat, onder anaërobe omstandigheden, wanneer er geen glucose meer aanwezig is (door het centrifugeren en resuspenderen van biomassa in glucosevrij medium), de PDC-activiteit van C. utilis met 50% werd verminderd. De PDC-activiteit werd hersteld door toevoeging van glucose aan het medium onder anaërobe omstandigheden; als de cultuur echter werd belucht naast glucosesuppletie, was er geen verandering in de PDC-activiteit. Een dergelijke enzymactivering komt niet voor bij alle koolhydraatsoorten. Wanneer gistsoorten anaeroob worden gekweekt op glycosiden die het Kluyver-effect geven, wordt de PDC-activiteit verminderd in vergelijking met glycosiden, zoals glucose, die anaeroob kunnen worden gemetaboliseerd (Sims and Barnett, 1991). Als resultaat van hun onderzoek, vonden zij dat PDC-activiteit tariefbeperkende in anaërobe omstandigheden kan zijn. Deze bevinding is in overeenstemming met die van Van Urk et al. (1989).

PDC is een substraat-pyruvaat-geactiveerd enzym (Hubner et al., 1978; Hohmann, 1997), dat ook allosterisch wordt geremd door anorganisch fosfaat (Boiteux en Hess, 1970). Boiteux en Hess meldden een toename van de Michaelisconstante (Km) van gezuiverde PDC uit S. carlsbergensis van 1,3 mm in afwezigheid van anorganisch fosfaat tot ongeveer 11 mM in aanwezigheid van 100 mm fosfaat. Het remmende effect bleek competitief van aard te zijn, aangezien de variatie in Km geen effect had op de maximale activiteit van het enzym. De gevoeligheid van PDC voor remming door fosfaat werd vastgesteld in dezelfde orde van grootte als de gevoeligheid van PDC voor activering door pyruvaat.

Saccharomyces spp. en C. utilis worden algemeen gebruikt voor de productie van l-PAC; nochtans, in vroeg werk, werd weinig gedaan om enzymactiviteiten direct te vergelijken. De PDC ‘ s van S. cerevisiae en C. utilis werden vergeleken door van Dijken en Scheffers (1986), en van Urk et al. (1989). Zij stelden vast dat de activiteit van PDC uit S. cerevisiae ongeveer acht keer zo groot was als die van PDC uit C. utilis, hoewel werd vastgesteld dat de PDC van de eerste gevoeliger was voor remming door fosfaat. Wat fosfaat betreft, vertoonde de PDC van C. utilis vergelijkbare Km-waarden als die van S. carlsbergensis, namelijk 3.6 mm bij afwezigheid van fosfaat en 11 mm bij aanwezigheid van 100 mm fosfaat. PDC van S. cerevisiae daarentegen vertoonde Km-waarden van 3,0 mm in afwezigheid van fosfaat en 48 mm in aanwezigheid van 100 mm fosfaat. Bijgevolg speelt de beschikbaarheid van fosfaat een belangrijke rol in de activiteit van PDC en dus PDC productiviteit. Een combinatie van reductie van de cytosolische fosfaatconcentratie en verhoogde pyruvaatconcentraties werd voorgesteld door Van Urk et al. (1989) als bijdragende factoren aan verhoogde PDC-activiteit na pulseren van de cultuur met glucose. Het proces gebruikt door Oliver et al. (1997) betrokken pulseren met melasse halverwege de fermentatie, vandaar een soortgelijke toename van de PDC-activiteit zou hoogstwaarschijnlijk hebben geresulteerd.Rogers en zijn collega ‘ s (Chow et al., 1995; Shin and Rogers, 1996a; Rogers et al., 1997) om de kinetiek van PDC van C. utilis in zowel gezuiverde vorm als in hele cellen te evalueren. Ze registreerden PDC-activiteiten van 0,85-0,9 u/mg eiwit voor hele, stationaire fase biomassa na groei in batch cultuur. Na gedeeltelijke zuivering, Chow et al. (1995) noteerde een toename van de PDC-activiteit tot 4,8 u/mg eiwit, die vergelijkbaar was met commercieel verkregen PDC. Pohl (1997) suggereert dat een specifieke activiteit in het bereik van 45-60 U/mg kan worden bereikt voor PDC gezuiverd uit gist en planten.

Rogers et al. (1997) rapporteerde een aantal kinetische parameters voor gezuiverde PDC Uit C. utilis. De Km-waarden voor benzaldehyde en pyruvaat waren respectievelijk 42 mm (4 °C, pH 7,0) en 2,2 mm (25 °C, pH 6,0), met concentraties van meer dan 10 mm pyruvaat die nodig zijn om verzadigingsomstandigheden te verkrijgen. De inhibitieconstante (Ki) voor aceetaldehyde was ongeveer 20 mm, terwijl substraatremming duidelijk was bij benzaldehydeconcentraties van meer dan 180 mm (19,1 g/l).

Chow et al. (1995) ondernam studies om de kinetiek van deactivering van PDC door benzaldehyde te bepalen. Zij stelden vast dat de deactivering volgde op eerste orde kinetiek voor benzaldehyde; de respons was echter niet lineair gerelateerd aan de tijd voor benzaldehydeconcentraties tussen 100 en 300 mm.in veel van de werkzaamheden die werden verricht met betrekking tot de productie van L-PAC is gebleken dat PDC niet de factor is die de productie van L-PAC beperkt (Vojtisek en Netrval, 1982; Shin en Rogers, 1996a; Tripathi et al., 1997) sinds enige PDC activiteit bleef aan het einde van de fermentaties. Integendeel, zowel Tripathi en medewerkers (1997) en Vojtisek en Netrval (1982) vonden dat lage pyruvaatconcentratie in de middelmatige beperkte opbrengsten. Glycolytische enzymen werden door zowel Tripathi als collega ‘ s en Nikolova en Ward (1991) als potentieel snelheidsbegrenzer betrokken.

Op basis van bovenstaande informatie, de Voorwaarden gebruikt door Oliver et al. (1997) (zie hoofdstuk 4) blijken zeer bevorderlijk te zijn voor de productie van L-PAC. Pyruvaat is in aanzienlijke hoeveelheden aanwezig en volgens Hohmann (1997) is de capaciteit van pyruvaatdehydrogenase beperkt in vergelijking met die van PDC, waardoor het metabolisme van pyruvaat via de enige alternatieve route wordt beperkt. Verder wordt de biomassa aangevuld met koolhydraten in combinatie met verminderde beluchting. Het werk van Sims en Barnett (1991) en Sims et al. (1991) geeft aan dat de combinatie van deze twee voorwaarden bevorderlijk is voor de inductie van PDC.