introduktion

medel som inducerar eller initierar vasodilatation, utvidgning av blodkärl, är vasodilatatorer, som ofta används för att behandla tillstånd med onormalt högt blodtryck, såsom hypertoni, angina och kongestiv hjärtsvikt (Bader och Zolty, 2010; Whelton et al., 2018). Typer av vasodilatatorer med olika mekanismer, såsom kalciumkanalblockerare, ACE-hämmare,cGMP-specifika 3′, 5′-cykliska fosfodiesteras-hämmare (PDE5) och kaliumkanalöppnare, har godkänts i kliniken (Saji et al., 2014). Trots överflödet av vasodilatatoralternativ måste vissa problem, inklusive universalitet och svårighetsgrad av högt blodtryck, läkemedelsresistens och narkotikamissbruk, delvis hanteras genom utveckling av nya läkemedel (Oparil och Schmieder, 2015). Till skillnad från nuvarande läkemedel med specifika mål för att utvidga blodkärlen, strävar vi efter att bygga en alternativ strategi som systematiskt kan utforska vasodilatatorer genom att rekapitulera det molekylära nätverket av vasodilatation.

Systembiologiska tillvägagångssätt är naturligt lämpade för att fånga de objektiva, storskaliga avläsningarna från komplexa system (Berger och Iyengar, 2009). Uttrycksprofilbaserade metoder är de mest generella, med hjälp av transkriptionsprofiler som signaturer av aktiviteten hos en given väg, sjukdom eller förening för att upptäcka ”kopplingar” mellan dem baserat på deras (anti)korrelerade transkriptionseffekter, såsom ”Anslutningskartan” (Lamb et al., 2006). Inspirerad av detta övervägande är det tänkt att bygga specifika funktionella genmoduler av vaskulär fenotyp från genomskalans funktionella karta. Förändringar av modulerna bör vara starkt associerade med patogenesen av vaskulär diameter. Modulerna kan användas som frågor för att undersöka transkriptionssvaret för läkemedel för att identifiera kandidat vasodilatatorer.

traditionell kinesisk medicin (TCM), med naturliga örter som viktiga material, har spelat en avgörande roll för människors hälsa i Kina. TCM involverar massor av aktiva ingredienser, som vanligtvis används som en källa till nya kemiska enheter för modern läkemedelsupptäckt (Tian, 2011). Nya storskaliga samarbetsinsatser har producerat kompendier av molekylära profiler för växtbaserade ingredienser (Lv et al., 2017). I det nuvarande arbetet försöker vi bygga en transkriptombaserad funktionell genmodulreferens (TFGMR) – strategi som kan karakterisera funktionella genmoduler relaterade till vaskulär diameter i transkriptionsdata för en samling växtbaserade föreningar för att utvärdera effekterna av dessa föreningar på vaskulär diameter.

material och metoder

genuttrycksdata och Preprocess

genuttrycksdata för växtbaserade föreningar erhölls från en systematisk studie på TCM-komponenter med användning av genuttrycksmikroarraytekniken (Lv et al., 2017). Dessa små föreningar var vanliga i kinesiska örter och TCM-formler, och de flesta av dem är kvalitetskontrollkomponenterna i Tcms från China Pharmacopoeia. Genuttrycksdata härleddes från human breast cancer epithelial cell line (MCF7) behandlad med dessa växtbaserade föreningar, profilerade med hjälp av microarray-teknik med Affymetrix Human Genome U133A 2.0 och samlades in från National Center for Biotechnology Information (NCBI) genuttryck Omnibus (GEO series anslutningsnummer: gse85871). Rådata (CEL-filer) behandlades konsekvent genom att tillämpa Affymetrix-plattformsspecifik procedur för att filtrera och normalisera datamängder. Sedan, för varje växtbaserad förening, beräknades de differentiella genuttrycksvärdena kontra kontrollprover av R-paketet” Limma ” (version 3.32.7). Genlistan för varje förening producerades genom att beställa gener i en rankad lista enligt deras differentiella uttrycksvärden.

identifiering av funktionell Genmodul för reglering av Blodkärlsdiameter

två funktionella genmoduler som positivt och negativt reglerar blodkärlsdiametern (PFGM och NFGM) konstruerades i detta arbete. För det första samlades två Gen ontologi (GO) biologiska processer (BPs) ”positiv reglering av blodkärlsdiameter” (GO: 0097755) och ”negativ reglering av blodkärlsdiameter” (GO: 0097756) från QuickGO: ett webbaserat verktyg för GO-sökning (http://seek.princeton.edu/) (Zhu et al., 2015). De resulterande generna med co-expression score > 0 och p värde < 0.01 I SEEK betraktades som co-uttryckta gener av frågekärngener. Slutligen avlägsnades de överlappande generna i två genuppsättningar, och resten gener komponerade PFGM respektive NFGM (kompletterande tabeller 1 och 2).

Anrikningsanalys av funktionella genmoduler i växtbaserade Föreningsinducerade Genuttrycksprofiler

anrikningarna av PFGM och NFGM med växtbaserade föreningsinducerade genuttrycksprofiler utvärderades med användning av genuppsättningsanrikningsmetoden (GSEA), implementerad i R–paketen, ”Gsea–P” (Subramanian et al., 2005). GSEA beräknar Anrikningspoäng (er) för genuppsättningar med avseende på rankad lista. ES värdeområde är . Det är ett mått baserat på Kolmogorov–Smirnov-statistiken och utvärderar överrepresentationen av genuppsättningar i ytterligheterna (topp eller botten) på rankad lista. Ju närmare ES är 1, desto närmare är generna högst upp på listan (gener tenderar att ökas i tillståndet). Ju närmare -1, desto närmare är generna längst ner på listan (gener tenderar att minskas i tillståndet).

i detta arbete representerar PFGM och NFGM molekylära signaturer av blodkärlets diameter. För att utvärdera effekterna av växtbaserade föreningar på blodkärlets diameter mättes ES-värdena (ESPFGM och ESNFGM) för PFGM och NFGM för varje föreningsinducerad genuttrycksprofil. Värdet TES = ESPFGM-ESNFGM användes som ett index för att bedöma påverkan av varje växtbaserad förening på blodkärlets diameter. För en förening, ju större dess tes-värde desto starkare är dess förmåga att utvidga blodkärlen. Ju mindre dess TES-värde desto starkare är dess förmåga att förtränga blodkärlet.

karakterisering av de Föreningsreglerade generna i PFGM och NFGM

i detta arbete, för varje förening, är dess reglerade gener i PFGM och NFGM ekvivalenta med den ledande delmängden som definieras som kärnmedlemmarna i de två modulerna som bidrar till ES i GSEA-metoden. Den ledande delmängden kan tolkas som kärnan i en genuppsättning som står för anrikningssignalen. Den ledande delmängden av PFGM och NFGM för varje föreningsinducerad genuttrycksprofil kan extraheras med metoden implementerad i R-paketen, GSEA-P.

kemikalier och läkemedel

ferulsyra (98% renhet), liquiritin (98% renhet), magnolol (98% renhet) och ginsenosid Rb2 (93,8% renhet) erhölls från National Institutes for Food and Drug Control (NIFDC, Peking, Kina). Borneol (98% renhet), ginsenosid Rc (98% renhet), artemisinin (99% renhet), chenodeoxikolsyra (98% renhet), daidzin (98% renhet) och bacopaside I (98% renhet) köptes från Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd. Andra reagenser var av analytisk renhet.

försöksdjur

fyrtio manliga Sprague-Dawley (SD) råttor som väger 230-250 g vid 7-9 veckors ålder och köptes från Djuruppfödningscentret i Beijing Vital River Laboratories Company (Peking, Kina). Råttorna hölls under en 12 h ljus / mörk cykel och hade fri tillgång till mat och vatten. Djuren togs om hand av China Academy of Chinese Medical Sciences’ Laboratory Animal Care Center. Alla djurförsök utfördes i enlighet med rekommendationerna från institutionella riktlinjer och etik. Protokollet godkändes av Animal Ethical and Welfare Committee, China Academy of Chinese Medical Sciences.

beredning av aorta ringar för Spänningsmätningar

ex vivo-experimentet utfördes på thorax aortas hos råttor enligt det protokoll som beskrivits tidigare (Chen et al., 2019). Namnlösa: råttorna bedövades genom intraperitoneal injektion av klorhydrat och offrades sedan genom cervikal dislokation. Efter öppnandet av bröstet erhölls råttornas bröstkorgsaortor och placerades omedelbart i iskall Krebs-Henseleit (KH) lösning med följande sammansättning (i mmol/L): NaCl 120, KCL 4,8, MgSO4•7H2O 1,2, KH2PO4 1,2, CaCl2 2,5, NaHCO3 25 och glukos 11 (pH 7,4). Fettvävnaden som vidhäftade artärerna avlägsnades försiktigt för att undvika endotelcellskador och blodkärlet skars i cirka 3 mm långa ringar. I de endotel-denuderade experimenten avlägsnades endotelet mekaniskt genom att försiktigt gnugga den luminala ytan av aortaringen fram och tillbaka flera gånger med plaströr. Aorta ringar suspenderades i organbad innehållande 5 ml KH-lösning vid 37 c c gasad med 95% O2 + 5% CO2, som bibehölls ständigt under experimenten. Efter jämvikt under ingen spänning i 20 minuter fick aortaringarna jämviktas i 90 minuter vid en vilospänning på 1,0 g. under jämviktsperioden ändrades KH-lösningen var 20: e minut. Förändringar i spänning registrerades av kraftgivare (FT-102, Chengdu Techman Software Co., Ltd. Kina) ansluten till ett datainsamlingssystem (BL-420F, Chengdu Techman Software Co., Ltd. Kina) och lagrades i en dator. För att säkerställa noggrannheten och repeterbarheten av studien valdes dessutom 3,0–4,5 g som inklusionskriteriet för prekontraktil kraft enligt preliminära experiment.

effekter av växtbaserade komponenter på kontraktion inducerad av fenylefrin

vid den stadiga sammandragningen inducerad av fenylefrin (Phe) (1 msk/L) i aortaringar tillsattes en kumulativ koncentration av växtbaserade komponenter (upplöst i KH-lösning eller innehållande 0,2% DMSO) direkt till organbadet och effekten av växtkomponenten registrerades. Samma volym KH-lösning tillsattes till fordonskontrollgruppen och svaren stoppades genom att tvätta aortaringarna med färsk KH-lösning. Effekterna uttrycktes som procentandelen avkoppling inducerad av växtbaserade komponenter.

dataanalys

För det första, för att bedöma betydelsen av effekterna av växtbaserade föreningar på den vaskulära fenotypen som representeras av de två funktionella modulerna, beräknade vi ett nominellt P-värde för varje TES-värde genom att jämföra fördelningen av det faktiska värdet till en nollmodell som erhöll TES-värden för varje förening genom slumpmässigt provtagning av genmedlemmar av PFGM och NFGM 1000 gånger med bevarade antal av de två modulerna (kompletterande tabell 3). För det andra mättes betydelsen av den överlappande analysen mellan regleringen av de sex föreningarna med avslappnande effekter med Fishers exakta test (Tilläggstabell 5). Slutligen följer den statistiska analysen av den funktionella anteckningen av genuppsättningar i WebGestalt (http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/annotate.jsp) instruktionerna på motsvarande webbplats.

Vasorelaxatorisk aktivitet uttrycks som procentuell avslappning av Phe-nivåer (1 msk/l). Värdena uttrycks som de medel som krävs av resultaten av de åtta proverna. Skillnader mellan grupperna bestämdes genom envägsanalys av varians. Statistisk signifikans definierades som P < 0,05. Koncentrationen för 50% av maximal effekt (EC50) värden för in vitro-experiment erhölls genom icke-linjär regression. Generering av grafer och statistisk analys utfördes med hjälp av GraphPad Prism (GraphPad Software, version 5.01) och SPSS 18.0 programvara.

resultat

Transkriptombaserad funktionell Genmodul referens

Vi presenterar en tfgmr-strategi som kan berika sjukdomsrelaterade funktionella genmoduler i läkemedelsinducerade transkriptionsprofiler för att detektera läkemedlets terapeutiska förmåga för sjukdomar genom att reglera specifika funktionella mekanismer. Här appliceras TFGMR på transkriptomresurser för 102 växtbaserade komponenter för att systematiskt upptäcka nya vasodilatatorer genom att reglera blodkärlets diameter (Figur 1). För det första konstruerade vi två funktionella genmoduler PFGM och NFGM som positivt och negativt reglerar blodkärlets diameter. Pfgm innehåller 167 genmedlemmar, varav 55 kärngener härledda från GO BP” positiv reglering av blodkärlsdiameter ” (GO: 0097755) och 112 samuttryckta gener av kärngenerna (kompletterande Tabell 1). NFGM innehåller 122 medlemmar, inklusive 72 kärngener från GO BP” negativ reglering av blodkärlsdiameter ” (GO: 0097756) och deras 50 co-uttryck (kompletterande Tabell 2). Sedan undersökte vi anrikningen av både PFGM och NFGM till var och en av de växtbaserade föreningsinducerade genuttrycksprofilerna genom GSEA–tillvägagångssätt för att bedöma effekten av varje växtbaserad förening på blodkärlets diameter.

karakterisering av funktionell Genmodul för reglering av Blodkärlsdiameter

vi karakteriserade PFGM och NFGM med avseende på både Go och pathway anrikning för att bedöma den funktionella föreningen av de två modulerna med vaskulär fenotyp genom att använda WebGestalt (Liao et al., 2019). GO-analysen av topp 10 BPs visade att både PFGM och NFGM involverar samma BPs av ”divalent oorganisk katjonhomeostas”, ”reglering av anatomisk strukturstorlek”, ”cirkulationssystemprocess”, ”muskelsystemprocess”, ”g–proteinkopplad receptorsignaleringsväg” och ”andra messenger-medierad signalering” (Figur 2). På liknande sätt visade väganalys av topp 10 Kyoto-encyklopedin av gener och genom (KEGG) vägar att de två modulerna var signifikant involverade i vägar för ”reglering av lipolys i adipocyter”, ”cyklisk guanosinmonofosfat (cGMP)-cGMP–beroende proteinkinas (PKG) signalväg”, ”kalciumsignalväg”, ”vaskulär glatt muskelkontraktion” och ”neuroaktiv ligand-receptorinteraktion” (Figur 2). Både Go och pathway termer berikade för PFGM och NFGM är uppenbarligen relaterade till den vaskulära fenotypen.

förutsäga kandidat vasodilatatorer från växtbaserade komponenter av Tfgmr

vårt antagande är att vasodilatatorer mestadels bör öka uttrycket av PFGM (ESPFGM > 0) medlemmar och minska NFGM (ESNFGM < 0). Därför valdes värdet TES = ESPFGM − ESNFGM som ett index för att identifiera kandidat vasodilatatorer. För en förening, ju större dess TES-värde, desto högre är dess förmåga att utvidga blodkärlen. De beställda genlistorna producerades först för de 102 växtbaserade komponentinducerade genuttrycksprofilerna. Sedan användes gsea-metoden för att mäta TES-värdet för varje växtbaserad förening. De 102 föreningarna beställdes efter deras TES-värden och beskrivs i Tilläggstabell 3. De 10 bästa kandidatföreningarna och deras TES-värden listades i Tabell 1.

de Vasorelaxanta effekterna av topp 10 Kandidatkomponenter på Phe-kontraherade Aortaringar

de vasorelaxanta effekterna av topp 10 förutspådda kandidat vasodilatatorer utvärderades på vaskulär spänning av endotel-intakta thorax aorta ringar förträngda av Phe. Typiskt originalspår visade att KH-lösning (kontrollgrupp, innehöll 0,2% DMSO) inte slappna av vaskulära ringar förkonditionerade med Phe (kompletterande Figur 1). Jämfört med kontrollgruppen visade alla 10 växtbaserade komponenter signifikanta och dosberoende vasorelaxant effekter på Phe-kontraherade aortaringar (P < 0,05, Figur 3). Bland dem presenterade ferulsyra den mest kraftfulla vasodilatationen (Emax = 87,46 2,90 2,90%), medan den minsta potensen framkallades av liquiritin (Emax = 11,10 3,34%) (Figur 3 och Tabell 1). Denna höga nivå på nya förutsägelser indikerade att tfgmr-strategin är praktiskt användbar vid förutsägelse av nya vasorelaxantmedel och har potentiella tillämpningar inom läkemedelsutveckling.

härledande mekanismer för växtbaserade föreningar med Vasorelaxant effekter

de sex föreningarna med uppenbara avslappnande effekter undersöktes för deras motsvarande mekanismer baserat på deras reglering på PFGM och NFGM. För det första undersökte vi kärngener som regleras signifikant i de två modulerna av de sex föreningarna. För varje förening är de reglerade generna medlemmarna i den ledande delmängden av anrikningsanalysen (se material och metoder). Som visas i kompletterande Tabell 4 påverkar ferulsyra, borneol, daidzin, magnolol, chenodeoxikolsyra och artemisinin 67, 59, 50, 58, 59, och 59 gener i PFGM, och 52, 49, 39, 44, 44, och 43 gener i NFGM respektive. De reglerade generna av dessa föreningar jämfördes, och det visade sig att de reglerade generna för de sex föreningarna överlappar varandra signifikant (kompletterande Tabell 5, Fishers exakta test P << 0.01), vilket innebär att de sex föreningarna delar liknande mekanismer för deras avslappnande effekter. Detta validerades ytterligare genom funktionell analys av dessa reglerade gener av dessa föreningar. I de 27 bästa berikade Go-termerna berikas de reglerade generna av de sex föreningarna signifikant i åtta samma Go-termer relaterade till vaskulär fenotyp, inklusive vaskulär process i cirkulationssystemet, reglering av vasokonstriktion, reglering av rörstorlek, reglering av systemprocess, reglering av blodcirkulationen, reglering av anatomisk strukturstorlek och cirkulationssystemprocess. Förutom de liknande mekanismerna har varje förening också sin exklusiva mekanism. Till exempel kan ferulsyra och chenodeoxikolsyra reglera gener I go-termen ”jonhomeostas.”Borneol påverkar gener signifikant I go-termer ”reglering av cellulär komponentrörelse” och ”biologisk vidhäftning” (Figur 4 och kompletterande Tabell 6).

diskussion

högt blodtryck bidrar till de patofysiologiska konsekvenserna av de flesta hjärt-kärlsjukdomar. Således är inhibering eller reversering av högt blodtryck en ovärderlig strategi för behandling av hjärt-kärlsjukdomar och relaterad organskada (Carey et al., 2018). Även om det har funnits mer än 69 läkemedel i 15 olika klasser av antihypertensiva läkemedel, såsom kalciumantagonister, angiotensinkonverterande enzymhämmare, binjure-adrenoceptorantagonister, diuretika och direktverkande vasodilatatorer, har många fler hypertensive patienter resistent hypertoni eller är okontrollerade för icke-adherens eller intolerans mot tillgängliga antihypertensiva medel (Oparil och Schmieder, 2015). Därför behövs fortfarande nya medel för att bekämpa högt blodtryck. TCMs innehåller mestadels hundratals kemiska komponenter, som är substansbasen för TCM-farmakologi och ger en riklig källa för kemisk läkemedelsupptäckt. I detta arbete undersökte vi systemiskt effekterna av växtbaserade ingredienser på den vaskulära fenotypen genom att använda ett transkriptombaserat tillvägagångssätt, TFGMR.

vaskulär spänning har rapporterats spela en kritisk roll för att reglera blodtrycket. En av de dominerande mekanismerna för antihypertensiva läkemedel är att minska kärlmotståndet genom vasodilation. I den aktuella studien har vasorelaxanta effekter av de 10 bästa kandidatkomponenterna undersökts. Resultaten visade att alla de 10 komponenterna har varierande grader av vasodilation. Bland dem hade ferulsyra, borneol och daidzin starka avslappnande effekter, vilket överensstämmer med tidigare fynd (Suzuki et al., 2007; Deng et al., 2012; Silva-Filho et al., 2012; Zhao et al., 2014; Zhou et al., 2017; Santos et al., 2019). Magnolol, artemisinin och chenodeoxikolsyra framkallade en måttlig avslappning , vilket också överensstämmer med rapporterna från tidigare studier (Teng et al., 1990; Li et al., 2005; Seok et al., 2012; Wang et al., 2017). Dessutom rapporterade vårt arbete först vasorelaxant effekterna av fyra växtbaserade föreningar, liquiritin, ginsenosid Rc, bacopaside I och ginsenosid Rb2, även om effekten är låg (Emax (% Phe) < 30%, Tabell 1). Intressant visade sig att de vasorelaxanta effekterna av några av dessa komponenter överensstämde väl med de farmakologiska effekterna av deras ursprungliga örter (se detaljer i Tilläggstabell 7). Till exempel är ferulsyra och magnolol huvudkomponenter i TCM ”chuanxiong” (Ligusticum chuanxiong Hort) och ”houpo” (Magnolia officinalis Rehd. et Wils), respektive. I TCM-teorin kan dessa örter främja” Qi ” – cirkulation i kroppen, skingra vind och eliminera fukt, i linje med teorin om vasodilatation (Liu et al., 2017). Detta resultat föreslog att tfgmr-strategin är en väl lämpad modell för att förutsäga vasorelaxant effekterna av TCM.

genuttrycksprofiler kan användas som en signatur av aktiviteten hos ett givet läkemedel eller en sjukdom för att hitta kopplingarna mellan droger och sjukdomar med hjälp av deras transkriptionssvar (Lamb, 2007; Subramanian et al., 2017). Den uttrycksprofilbaserade metoden har använts för ompositionering av läkemedel, målprognos och upptäckt immunmodulerande effekter av läkemedel (Iorio et al., 2010; Sirota et al., 2011; Kidd et al., 2016; Li et al., 2019). Med mer finkorniga, storskaliga omics-datamängder blir offentligt tillgängliga, möjliggör den nuvarande kunskapen en mer exakt avgränsning av den biologiska modulen/nätverket av patologiska processer. Vi identifierade och kommenterade här två kärldiameterrelaterade genmoduler PFGM och NFGM, genom att undersöka gener som är involverade i den positiva och negativa regleringen av kärldiametern från en genfunktionell karta i genomskala.

TFGMR används för att karakterisera anrikningen av PFGM och NFGM i de växtbaserade komponentinducerade genuttrycksprofilerna och definiera ett TES–värde för varje växtbaserad komponent för att mäta dess vasorelaxant effekt. De vasorelaxanta effekterna av de 10 bästa kandidatväxtkomponenterna undersöktes genom ex vivo-experiment av aorta ringkontraktion inducerad av Phe. Bland dem framkallade sex föreningar, ferulsyra, borneol, magnolol, artemisinin, chenodeoxikolsyra och daidzin en uppenbar avkoppling (Emax (% Phe) > 50%, Tabell 1) och kan användas som potentiella terapier för sjukdomar med högt blodtryck.

det bör noteras att även om endast en databas med växtbaserade kemikalier testades av TFGMR, är metoden verkligen lämplig för screening av alla kemikalier för vilka åtgärderna på genuttrycksnivåerna är kända. Dessutom bör kandidatföreningarna testas för deras direkta effekter på utvidgning av resistenskärl, vilket kommer att utvärderas med laserdopplerflödesmetri i ytterligare arbete.

datatillgänglighet uttalande

offentligt tillgängliga dataset analyserades i denna studie. Dessa data kan hittas här: NCBI genuttryck Omnibus, GEO-serien anslutningsnummer: GSE85871.

Etikuttalande

djurstudien granskades och godkändes av China Academy of Chinese Medical Sciences’ Laboratory Animal Care Center.

Författarbidrag

PL och CC utformade forskning, utförde experiment, analyserade data och skrev manuskriptet. WZ, DY och SL utförde experiment och samlade in och analyserade data. JZ och AL övervakade arbetet och skrev och granskade manuskriptet.

finansiering

denna forskning stöddes av National Natural Science Foundation of China (nr 81703945, nr 31800678) och teknik-och innovationsfonden för Shanxi Agricultural University (nr 2016yj17, nr 2017yj40).

intressekonflikt uttalande

författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som kan tolkas som en potentiell intressekonflikt.

tilläggsmaterial

Tilläggsmaterialet för denna artikel finns online på: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2019.01144/full#supplementary-material