Úvod

látek, které indukují nebo iniciovat rozšíření cév, rozšíření cév, jsou vazodilatátory, které jsou často používány k léčbě stavů s abnormálně vysoký krevní tlak, jako je hypertenze, angina pectoris, městnavé srdeční selhání (Bader a Zolty, 2010; Whelton et al., 2018). Typy vazodilatancia s různými mechanismy, jako jsou blokátory kalciových kanálů, inhibitory angiotenzin-konvertujícího enzymu (ACE) inhibitory cGMP-specifickou 3′,5′-cyklický inhibitory fosfodiesterázy (PDE5), a draselný kanál otvíráky, byly schváleny v klinice (Saji et al., 2014). I přes nepřeberné množství vazodilatační možnosti, některé problémy, včetně univerzálnosti a závažnosti vysokého krevního tlaku, lékové rezistence, a drogovou závislost je třeba řešit, v části, o vývoji nových léků (Oparil a Schmieder, 2015). Odlišné od současných léků s konkrétní cíle k dilataci cév, naším cílem je vytvořit alternativní strategie, který je schopen systematicky zkoumá vazodilatancia tím, recapitulating molekulární síť vazodilataci.

přístupy systémové biologie jsou přirozeně vhodné pro zachycení nezaujatých, rozsáhlých odečtů z komplexních systémů (Berger and Iyengar, 2009). Výraz profilu na základě metody jsou nejvíce obecné ty, pomocí transkripční profily jako podpisy činnosti dané dráhy, onemocnění, nebo složené objevit „spojení“ mezi nimi na základě jejich (anti)korelované transkripční účinky, jako je „Připojení Mapě“ (Lamb et al., 2006). Inspirován touto úvahou, je koncipován k vytvoření specifických funkčních genových modulů vaskulárního fenotypu z funkční mapy genomu. Změny modulů by měly být do značné míry spojeny s patogenezí vaskulárního průměru. Moduly lze použít jako dotazy ke zkoumání transkripční odpovědi léčiv k identifikaci kandidátských vazodilatátorů.

Tradiční čínská medicína (TCM), s přírodními bylinami jako hlavními materiály, hrála klíčovou roli v lidském zdraví v Číně. TCM zahrnuje spoustu účinných látek, které se obvykle používají jako zdroj nových chemických entit pro moderní objev léčiv (Tian, 2011). Nedávné rozsáhlé společné úsilí přinesly přehledy molekulární profily pro bylinné přísady (Lv et al., 2017). V této práci, se budeme snažit vybudovat transcriptome založené na funkční gen modul reference (TFGMR) strategie, která je schopna charakterizovat funkční genové moduly týkající se cévní průměr v transkripční údaje z kolekce bylinné sloučeniny pro vyhodnocení dopadu těchto látek na cévní průměru.

Materiály A Metody

Dat Genové Exprese a Preprocess

dat Genové exprese rostlinných sloučenin byly získány ze systematické studium na TCM komponenty pomocí gene expression microarray techniky (Lv et al., 2017). Tyto malé sloučeniny byly běžné v čínských bylinách a vzorcích TCM a většina z nich jsou komponenty kontroly kvality TCM z čínského lékopisu. Exprese genu údaje byly odvozeny z lidského prsu epiteliální buněčnou linií (MCF7), kteří byli léčeni tyto bylinné sloučeniny, profilované pomocí microarray technologie s Affymetrix Lidského Genomu U133A 2.0, a shromážděné z Národního Centra pro Biotechnologické Informace (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO série přistoupení číslo: GSE85871). Nezpracovaná data (cel soubory) byly zpracovány důsledně použitím Affymetrix platform-specific postup filtrovat a normalizovat datové sady. Pak byly pro každou bylinnou sloučeninu vypočteny hodnoty diferenciální genové exprese oproti kontrolním vzorkům R package „Limma“ (verze 3.32.7). Seznam genů pro každou sloučeninu byl vytvořen uspořádáním genů v hodnoceném seznamu podle jejich hodnot diferenciální exprese.

Identifikace Funkční Gen Modul Regulace Průměru cévy

Dvě funkční genové moduly, které pozitivně a negativně regulují krevní cévy průměr (PFGM a NFGM) byly postaveny v této práci. Za prvé, dva Gene Ontology (GO), biologické procesy (BPs) „pozitivní regulace průměru cévy“ (GO: 0097755) a „negativní regulace průměru cévy“ (GO: 0097756) byly shromážděny od QuickGO: web-based nástroj pro vyhledávání (http://seek.princeton.edu/) (Zhu et al., 2015). Výsledné geny s koexpresí skóre > 0 a P hodnota < 0.01 v USILOVAT byly považovány za co-vyjádřil geny dotaz jádro geny. Nakonec byly odstraněny překrývající se geny ve dvou genových sadách a zbytek genů složil PFGM a NFGM (doplňkové tabulky 1 a 2).

Obohacení Analýzy Funkčních Genových Modulů v Bylinné Směsi–Indukované Genové Exprese Profily

obohacení z PFGM a NFGM s bylinné směsi–indukované genové exprese profily byly vyhodnoceny pomocí genetické nastavit obohacení přístup (GSEA), realizované v R. balíčky, „GSEA-P“ (Subramanian et al., 2005). GSEA vypočítá skóre obohacení pro sady genů s ohledem na hodnocený seznam. Rozsah hodnot ES je . Jedná se o opatření založené na statistikách Kolmogorov–Smirnov a vyhodnocuje nadměrné zastoupení genových sad v extrémech (nahoře nebo dole) hodnoceného seznamu. Čím blíže je ES k 1, tím blíže jsou geny na vrcholu seznamu (geny mají tendenci se ve stavu zvyšovat). Čím blíže k -1, tím blíže jsou geny ke dnu seznamu (geny mají tendenci být ve stavu redukovány).

v této práci představují PFGM a NFGM molekulární podpisy průměru krevních cév. Pro vyhodnocení účinků rostlinných sloučenin na průměr krevních cév byly měřeny hodnoty ES (ESPFGM a ESNFGM) PFGM a NFGM pro každý profil exprese genu indukovaný sloučeninou. Hodnota TES = ESPFGM-ESNFGM byla použita jako index k posouzení vlivu každé bylinné sloučeniny na průměr krevních cév. U sloučeniny, čím větší je její hodnota TES, tím silnější je její schopnost dilatovat krevní cévy. Čím menší je jeho hodnota TES, tím silnější je jeho schopnost zúžit krevní cévy.

Charakterizaci Sloučeniny-Regulované Geny v PFGM a NFGM

V této práci, pro každou sloučeninu, její regulované geny v PFGM a NFGM jsou rovnocenné špičkové podmnožina, který je definován na základní členy dvou modulů, které přispívají k ES v GSEA metoda. Podmnožinu náběžné hrany lze interpretovat jako jádro genové sady, která odpovídá za obohacovací signál. Přední podmnožina PFGM a NFGM pro každý profil exprese genu indukovaný sloučeninou může být extrahována metodou implementovanou v r balíčcích, GSEA-P.

Chemikálie a Léky

Ferulová kyselina (98% čistota), liquiritin (98% čistota), magnolol (98% čistoty), a ginsenoside s příponou rb2 (93.8% čistota) byly získány z Národního institutu pro Potraviny a Kontrolu léčiv (NIFDC, Peking, Čína). Borneol (98% čistota), ginsenoside Rc (98% čistota), artemisininu (99% čistota), chenodeoxycholová (98% čistota), daidzin (98% čistoty), a bacopaside jsem (98% čistota) byly zakoupeny od Šanghaje yuanye Bio-Technology Co., Ltd. Ostatní činidla měla analytickou čistotu.

Pokusných Zvířat

Čtyřicet male Sprague-Dawley (SD) potkanů vážení 230-250 g ve věku 7-9 týdnů a byly zakoupeny z Chovu Zvířat Centru Pekingu Životně důležité Řeky Laboratoří Společnosti (Peking, Čína). Krysy byly udržovány v 12hodinovém cyklu světlo / tma a měly volný přístup k jídlu a vodě. O zvířata se postaralo laboratorní Centrum péče o zvířata Čínské akademie čínských lékařských věd. Všechny pokusy na zvířatech byly prováděny v souladu s doporučeními institucionálních pokynů a etiky. Protokol byl schválen výborem pro etiku a dobré životní podmínky zvířat, Čínská akademie čínských lékařských věd.

Příprava Aortální Kroužky pro Měření Napětí

ex vivo experiment byl proveden na hrudní aorty potkanů podle protokolu popsaného dříve (Chen et al., 2019). Konkrétně byly krysy anestetizovány intraperitoneální injekcí chloralhydrátu a poté byly obětovány cervikální dislokací. Po otevření hrudníku, krys hrudní aorty byly získány a jsou okamžitě umístěny v ledové Krebs–Henseleit (KH) roztok následujícího složení (v mmol/L): NaCl 120, KCL 4.8, MgSO4•7H2O 1.2, KH2PO4 1.2, CaCl2 2.5, NaHCO3 25 a glukózy, 11 (pH 7.4). Tuková tkáň ulpívající na tepnách byla opatrně odstraněna, aby se zabránilo poškození endotelových buněk, a krevní céva byla rozřezána na přibližně 3 mm dlouhé kroužky. V experimentech s obnaženým endotelem byl endotel mechanicky odstraněn jemným třením luminálního povrchu aortálního prstence několikrát tam a zpět plastovými hadičkami. Aortální kruhy byly suspendovány v orgánových lázních obsahujících 5 ml roztoku KH při 37°C plynovaných 95% O2 + 5% CO2, který byl udržován neustále po celou dobu experimentů. Po ustavení rovnováhy za žádné napětí po dobu 20 min, aortální prstenů bylo dovoleno, aby dosáhl rovnováhy po dobu 90 min při klidové napětí 1,0 g. Během ekvilibrace, KH roztok byl změněn každých 20 min. Změny napětí byly zaznamenány pomocí silových měničů (FT-102, Chengdu Techman Software Co., Ltd. Čína) připojeno k systému sběru dat (BL-420F, Chengdu Techman Software Co., Ltd. Čína) a byly uloženy v počítači. Kromě toho, aby byla zajištěna přesnost a opakovatelnost studie, bylo podle předběžných experimentů vybráno 3,0–4,5 g jako kritérium zařazení prekontrakční síly.

Účinky Bylinných Složek na Kontrakci Vyvolané Fenylefrinem

Na stabilní kontrakci vyvolané fenylefrinem (Phe) (1 µmol/L) v aortální kroužky, kumulativní koncentrace bylinné složky (rozpuštěné v KH roztoku nebo obsahující 0.2% DMSO) byl přidán přímo do orgánu vana, a účinek bylinné složky bylo nahráno. Stejný objem roztoku KH byl přidán do kontrolní skupiny vozidla a reakce byly zastaveny promytím aortálních kroužků čerstvým roztokem KH. Účinky byly vyjádřeny jako procento relaxace vyvolané bylinnými složkami.

Analýza Dat

za Prvé, posoudit význam vlivu rostlinných látek na cévní fenotyp zastoupen dvěma funkčními moduly, vypočítáme nominální hodnota P pro každé TES hodnotu porovnáním rozdělení skutečné hodnoty null model, který získal TES hodnoty pro každou sloučeninu tím, že náhodně vzorků gen členové PFGM a NFGM 1000 krát s dochovanými čísla ze dvou modulů (Doplňující Tabulka 3). Za druhé, význam překrývající analýzy mezi nařízením ze šesti sloučenin s relaxační účinky byla měřena pomocí Fisherova exaktního testu (Doplňující Tabulka 5). Konečně statistická analýza funkční anotace genových Sad ve WebGestalt (http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/annotate.jsp) se řídí pokyny příslušné webové stránky.

Vazorelaxační aktivita je vyjádřena jako procentuální uvolnění předtrakčních hladin Phe (1 µmol / L). Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± SD výsledků osmi vzorků. Rozdíly mezi skupinami byly určeny jednosměrnou analýzou rozptylu. Statistická významnost byla definována jako P < 0.05. Koncentrace pro 50% hodnot maximálního účinku (EC50) experimentů in vitro byla získána nelineární regresí. Generování grafů a statistická analýza byly prováděny pomocí GraphPad Prism (GraphPad Software, verze 5.01) a SPSS 18.0 software.

Výsledky

Transcriptome Založené na Funkční Gen Modul Reference

představujeme TFGMR strategie schopné obohacovat onemocnění souvisejících s funkční genové moduly drogami indukované transkripční profily pro detekci terapeutické schopnosti léků pro onemocnění tím, že reguluje specifické funkční mechanismy. Zde se TFGMR aplikuje na transkriptomové zdroje pro 102 rostlinných složek k systematickému objevování nových vazodilatátorů regulací průměru krevních cév (Obrázek 1). Nejprve jsme zkonstruovali dva funkční genové moduly PFGM a NFGM, které pozitivně a negativně regulují průměr krevních cév. PFGM obsahuje 167 gen členů, z toho 55 základní geny odvozené od BP „pozitivní regulace průměru cévy“ (GO: 0097755) a 112 co-vyjádřil geny jádra geny (Doplňující Tabulka 1). NFGM obsahuje 122 členů, včetně 72 jádro geny z GO BP „negativní regulace průměru cévy“ (GO: 0097756) a jejich 50 co-výrazy (Doplňující Tabulka 2). Pak jsme zkoumali obohacení obou PFGM a NFGM každé bylinné směsi–indukované genové exprese profily GSEA přístup, aby mohla vyhodnotit vliv každé bylinné směsi na průměru cévy.

Charakterizaci Funkční Gen Modul Regulace Průměru cévy

Jsme vyznačuje PFGM a NFGM s ohledem na oba JÍT a cestou obohacení posoudit funkční sdružení dvou modulů s cévní fenotyp pomocí WebGestalt (Liao et al., 2019). GO analýzy top 10 BPs ukázal, že oba PFGM a NFGM zahrnovat stejné BPs „dvojmocné anorganické kationty homeostázy,“ „nařízení o anatomické struktuře velikost,“ „oběhový systém, proces,“ „svalový systém, proces,“ „G protein–coupled receptor signální dráhy,“ a „second-messenger-zprostředkované signalizace“ (Obrázek 2). Podobně, cestou analýzy top 10 Kyoto encyclopedia of genů a genomů (KEGG) cesty, zobrazí se, že dva moduly byly významně zapojeny do drah „regulaci lipolýzy v adipocytech,“ „cyklický guanosin monofosfát (cGMP)-cGMP-dependentní protein kinázy (PKG) signální dráhy,“ „vápník signální dráhy,“ „cévní hladké svalové kontrakce,“ a „neuroaktivní ligand–receptor interakce“ (Obrázek 2). Termíny GO a pathway obohacené o PFGM a NFGM zjevně souvisejí s vaskulárním fenotypem.

Předpovídání Kandidáta Vazodilatancia Z Bylinných Složek TFGMR

Náš předpoklad je, že vazodilatancia měl by především zvýšení exprese PFGM (ESPFGM > 0) členy a oslabit NFGM (ESNFGM < 0). Proto byla hodnota TES = ESPFGM − ESNFGM vybrána jako index pro identifikaci kandidátských vazodilatátorů. U sloučeniny, čím větší je její hodnota TES, tím vyšší je její schopnost dilatovat krevní cévy. Uspořádané seznamy genů byly nejprve vyrobeny pro 102 profily genové exprese indukované rostlinnou složkou. Poté byla metoda GSEA použita k měření hodnoty TES pro každou bylinnou sloučeninu. 102 sloučenin bylo seřazeno podle jejich hodnot TES a podrobně popsáno v doplňkové tabulce 3. Top 10 kandidátských sloučenin a jejich hodnoty TES byly uvedeny v tabulce 1.

Vasorelaxant Účinky Top 10 Kandidáta Komponenty na Phe-Smluvně Aortální Kroužky

vasorelaxant účinky top 10 předpověděl kandidáta vazodilatancia byly hodnoceny na cévní napětí endotelu-neporušené hrudní aorty kroužky sevřené Phe. Typická původní stopa ukázala, že roztok KH (kontrolní skupina, obsahoval 0,2% DMSO)neuvolnil vaskulární kroužky předdefinované Phe (Doplňkový Obrázek 1). Ve srovnání s kontrolní skupinou, všech 10 bylinných složek prokázaly významnou a na dávce závislou vasorelaxant účinky na Phe-smluvně aortální kroužky (P < 0.05, viz Obrázek 3). Mezi nimi, ferulová kyselina představil nejsilnější vazodilatace (Emax = 87.46 ± 2.90%), přičemž minimální účinnost byla dosažena tím, že liquiritin (Emax = 11.10 ± 3.34%) (Obrázek 3 a Tabulka 1). Tato vysoká úroveň nových předpovědí naznačila, že strategie TFGMR je prakticky užitečná při predikci nových vazorelaxačních látek a má potenciální aplikace ve vývoji léčiv.

Odvozovat Mechanismy Rostlinné Sloučeniny S Vasorelaxant Účinky

šest sloučenin, s zřejmé, relaxační účinky byly zkoumány pro jejich odpovídajících mechanismů na základě jejich nařízení o PFGM a NFGM. Nejprve jsme zkoumali základní geny, které jsou ve dvou modulech významně regulovány šesti sloučeninami. Pro každou sloučeninu jsou regulované geny členy v podskupině předních hran analýzy obohacení (viz materiály a metody). Jak je uvedeno v Doplňující Tabulce 4, ferulová kyselina, borneol, daidzin, magnolol, chenodeoxycholová, a artemisininu vliv 67, 59, 50, 58, 59, a 59 genů v PFGM, a 52, 49, 39, 44, 44, a 43 genů v NFGM, resp. Regulované geny z těchto sloučenin byly porovnány a bylo zjištěno, že regulované geny pro šest sloučenin se významně překrývají s každou další (Doplňující Tabulka 5, Fisherův exaktní test P << 0.01), z čehož vyplývá, že šest sloučeniny sdílejí podobné mechanismy pro jejich relaxační účinky. To bylo dále ověřeno funkční analýzou těchto regulovaných genů těchto sloučenin. V horní 27 obohacený JÍT podmínky, regulované geny šest sloučenin, které významně obohatily v osm JÍT si pojmy týkající se cévní fenotyp, včetně cévních procesů v oběhovém systému, regulace vasokonstrikce, regulace velikosti trubky, regulace, systém, proces, regulaci krevního oběhu, regulace anatomické struktury, velikosti, a oběhový systém, proces. Kromě podobných mechanismů má každá sloučenina také svůj exkluzivní mechanismus. Například kyselina ferulová a kyselina chenodeoxycholová mohou regulovat geny v GO termínu “ iontová homeostáza.“Borneol výrazně ovlivnit geny v GO pojmy „regulace buněčné složky pohybu“ a „biologická adheze“ (Obrázek 4 a Doplňující Tabulka 6).

diskuse

vysoký krevní tlak přispívá k patofyziologickým důsledkům většiny kardiovaskulárních onemocnění. Inhibice nebo zvrácení vysokého krevního tlaku je tedy neocenitelnou strategií pro léčbu kardiovaskulárních onemocnění a souvisejících poškození orgánů (Carey et al., 2018). Ačkoli tam být více než 69 léky v 15 různých tříd antihypertenziv, jako jsou antagonisté kalcia, inhibitory angiotenzin-konvertujícího enzymu, beta-adrenergních receptorů, diuretika, a přímo působící vazodilatancia, mnoho pacientů s hypertenzí má rezistentní hypertenze nebo jsou nekontrolované pro nonadherence nebo nesnášenlivost k dispozici antihypertenziva (Oparil a Schmieder, 2015). Proto jsou pro boj s vysokým krevním tlakem stále zapotřebí nová činidla. TCM většinou obsahují stovky chemických složek, které jsou základem farmakologie TCM a poskytují bohatý zdroj pro objev chemických léčiv. V této práci jsme systémově zkoumali účinky rostlinných složek na vaskulární fenotyp pomocí přístupu založeného na transkriptomu, TFGMR.

bylo hlášeno, že vaskulární napětí hraje rozhodující roli při regulaci krevního tlaku. Jedním z dominujících mechanismů antihypertenziv je snížení vaskulární rezistence vazodilatací. V této studii byly zkoumány vazorelaxační účinky top 10 kandidátských složek. Výsledky ukázaly, že všech 10 složek má různé stupně vazodilatace. Mezi nimi měla kyselina ferulová, borneol a daidzin silné relaxační účinky, což je v souladu s předchozími zjištěními (Suzuki et al., 2007; Deng et al., 2012; Silva-Filho a kol., 2012; Zhao a kol., 2014; Zhou a kol., 2017; Santos a kol., 2019). Magnolol, artemisinin a kyselina chenodeoxycholová vyvolaly mírnou relaxaci, také v souladu se zprávami z předchozích studií (Teng et al ., 1990; Li et al., 2005; Seok et al., 2012; Wang a kol., 2017). Kromě toho, naše práce poprvé zaznamenána vasorelaxant účinky čtyř bylinné sloučeniny, liquiritin, ginsenoside Rc, bacopaside jsem, a ginsenoside s příponou rb2, ačkoli účinek je nízký (Emax (% Phe) < 30%, Tabulka 1). Je zajímavé, že bylo zjištěno, že vasorelaxant účinky některých z těchto komponent souhlasila dobře s farmakologickými účinky jejich původní byliny (podrobnosti naleznete v Doplňkové Tabulce 7). Například, kyselina ferulová a magnolol jsou hlavní součásti TCM „chuanxiong“ (Ligusticum chuanxiong Hort) a „houpo“ (Magnolia officinalis Rehd. et Wils), resp. V teorii TCM by tyto byliny mohly podporovat“ Qi “ cirkulaci v těle, rozptýlit vítr a eliminovat vlhkost v souladu s teorií vazodilatace (Liu et al ., 2017). Toto zjištění naznačilo, že strategie TFGMR je vhodným modelem pro předpovídání vazorelaxačních účinků TCM.

profily Genové exprese může být použit jako podpis činnosti daného léku nebo nemoci najít spojení mezi léky a onemocnění pomocí jejich transkripční odpovědi (Beránek, 2007; Subramanian et al., 2017). Vyjádření profil–založena metoda byla použita pro drogy přemístění, cíl predikce a objevování imunomodulační účinky léků (Iorio et al., 2010; Sirota a kol., 2011; Kidd et al., 2016; Li a kol., 2019). S více jemnozrnné, rozsáhlé omics datových sad, stává se veřejně k dispozici, současné poznání umožňuje přesnější vymezení biologických modulu/sítě patologických procesů. Jsme zde identifikovány a komentovaný dvě nádoby průměr–related gene moduly PFGM a NFGM, zkoumáním genů podílejících se na pozitivní a negativní regulace průměr nádoby z genomu měřítku gen funkční mapu.

TFGMR je využívána k charakterizaci obohacení PFGM a NFGM v bylinné složky indukované genové exprese profily a definovat CÍLOVÉ hodnoty pro každý bylinné složky změřit jeho vasorelaxant efekt. Vazorelaxační účinky 10 nejlepších kandidátských rostlinných složek byly zkoumány experimenty ex vivo kontrakce aortálního kruhu indukované Phe. Mezi nimi, šest sloučenin, kyselina ferulová, borneol, magnolol, artemisininu, chenodeoxycholová, a daidzin, vyvolal zřejmé, relaxace (Emax (% Phe) > 50%, Tabulka 1) a mohou být použity jako potenciální léčiva pro onemocnění s vysokým krevním tlakem.

Je třeba poznamenat, že i když jen databáze rostlinných látek byl testován TFGMR, metoda je skutečně vhodná pro screening chemických látek, pro které je akce na genovou expresi úrovně jsou známé. Kromě toho, kandidát sloučeniny měly být testovány na jejich přímý vliv na dilataci odpor cév, které budou hodnoceny laser Doppler flowmetrie v další práci.

Prohlášení o dostupnosti dat

veřejně dostupné datové sady byly analyzovány v této studii. Tyto údaje lze nalézt zde: NCBI genová exprese Omnibus, přístupové číslo řady GEO: GSE85871.

etické prohlášení

studie na zvířatech byla přezkoumána a schválena centrem laboratorní péče o zvířata Čínské akademie čínských lékařských věd.

Autor Příspěvky

PL a CC navržen výzkum, provádí experimenty, analyzovat data, a napsal rukopis. WZ, DY a SL prováděly experimenty a shromažďovaly a analyzovaly data. JZ a AL dohlíželi na práci a psali a přezkoumávali rukopis.

finanční Prostředky

Tento výzkum byl podporován Národní Přírodní Science Foundation Číny (Č. 81703945, Č. 31800678) a Technologie a Inovace Fond Shanxi Zemědělské Univerzity (Č. 2016YJ17, Č. 2017YJ40).

Prohlášení o střetu zájmů

autoři prohlašují, že výzkum byl proveden bez jakýchkoli obchodních nebo finančních vztahů, které by mohly být vykládány jako potenciální střet zájmů.

Doplňkový Materiál

Doplňkový Materiál pro tento článek lze nalézt online na adrese: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2019.01144/full#supplementary-material