2.2 Pyruvatdekarboxylas och tillhandahållande av substrat

som beskrivits ovan är PDC det enzym som ansvarar för produktionen av l-PAC. PDC befinns vanligtvis existera som antingen dimerer eller tetramerer, varigenom det aktiva PDC-holoenzymet generellt existerar som en tetramer, medan apoenzymet existerar som en dimer (Pohl, 1997). Förekomsten av dimer-och tetramerformerna är pH-beroende. I jäst har PDC rapporterats existera endast som en tetramer i pH–intervallet 5,5-6.5, som både tetramerer och dimerer vid pH-värden upp till 9,5, och dimerer endast vid pH > 9,5 (Pohl, 1997). Hohmann (1997) har dock rapporterat förekomsten av PDC endast i form av dimerer vid ett pH av 8, 4. PDC från Z. mobilis har visat sig existera endast i form av tetramerer (Pohl, 1997). Medan PDC-underenheter tidigare ansågs ha olika kompositioner, är de nu kända för att vara identiska (Hohmann, 1997).

totalt sex PDC-gener har identifierats i Saccharomyces cerevisiae, varav tre är strukturella gener (PDC1, PDC5 och PDC6) och de återstående tre anses vara gener relaterade till uttryck av PDC (PDC2, PDC3, PDC4) (Flikweert et al. 1996; Hohmann, 1997; Pohl, 1997; ter Schure et al., 1998). En enda strukturell gen som kodar för PDC har identifierats i Z. mobilis (Pohl, 1997). Medan majoriteten av arbetet inom detta område verkar ha utförts på S. cerevisiae, gener för PDC har identifierats i ett antal jästarter, inte inklusive Candida utilis. Flikweert och medarbetare genomförde studier för att bedöma rollen för var och en av isoenzymerna i den totala PDC-aktiviteten och fann att uttrycket för var och en av isoenzymerna i S. cerevisiae skilde sig åt. Med användning av batchkultur med antingen etanol eller glukos som kolsubstrat uttrycktes PDC1 konstitutivt medan PDC5 inducerades i närvaro av glukos. PDC6 var närvarande på obetydliga nivåer. Dessa resultat upprepades i en översyn av pyruvatdekarboxylaser av Hohmann (1997), som indikerade att endast PDC1 och PDC5 spelade en uppenbar roll i sockerkatabolism, med 80-90% och 10-20% av den totala PDC-aktiviteten som tillskrivs dessa två gener för glukosodlad biomassa.

förutom produktionen av acetoin har S. cerevisiae PDC visat sig vara involverad i produktionen av fuseloljor, som är smakföreningar som finns i alkoholhaltiga drycker och bröd. Fuseloljor produceras genom dekarboxylering av grenade 2-oxosyror, härledda från aromatiska aminosyror. Produkterna dehydrogeneras sedan av alkoholdehydrogenas (ADH). Aktiviteten av PDC med 2-oxosyrorna är signifikant lägre än för pyruvat (ter Schure et al., 1998). Produktion av nya aldehydanaloger diskuteras senare i detta kapitel.

PDC-aktivitet kan induceras och manipuleras både av graden av luftning som tillförs kulturen och genom valet av kolhydratsubstrat i mediet. PDC-aktivitet krävs för att möjliggöra glykolytiskt flöde endast under anaeroba förhållanden; därför bör en minskning av luftningen resultera i induktion av PDC. Både Sims och medarbetare (1991) och Rogers et al. (1997) har visat att en ökning av C. utilis PDC-aktivitet uppstår när syrekoncentrationen reduceras. Ett sådant svar är mycket fördelaktigt för produktionen av l-PAC. Båda grupperna av forskare fann emellertid att aktiviteten hos ADH, som är ansvarig för generering av oönskade biprodukter, överstiger den för PDC under anaeroba eller delvis anaeroba förhållanden. Effekten av luftningsbetingelser på jästfysiologi diskuteras senare i detta kapitel.

induktion av PDC-aktivitet av kolhydratkälla är beroende av den berörda jästarten och den levererade kolhydratkällan. Glukos är ett substrat som kan inducera glykolytiska enzymer, särskilt PDC. Ett antal arbetare har visat att tillsatsen av glukos till kulturer resulterar i en ökning av PDC-aktiviteten. Maitra och Lobo (1971) fann att tillsatsen av glukos som en puls till Saccharomyces spp. kulturer resulterade i en ökning av produktionen av glykolytiska enzymer, inklusive PDC, efter en kort fördröjningsperiod. Mediet som användes för tillväxt var kolhydratfritt och acetat användes som kolkälla. På samma sätt visade Schmitt och Zimmerman (1982) en 18-faldig ökning av PDC-aktiviteten hos S. cerevisiae efter att glukos tillsattes till en skakkolvkultur odlad på etanol som den enda kolhydratkällan. Dessa resultat överensstämmer med Harrison (1972) och Sims et al. (1991). Sims och medarbetare visade också den reversibla karaktären av PDC-aktivering. De visade att under anaeroba förhållanden, när de berövades glukos (genom centrifugering och återsuspendering av biomassa i glukosfritt medium) minskade PDC-aktiviteten hos C. utilis med 50%. PDC-aktivitet återställdes genom tillsats av glukos till mediet under anaeroba förhållanden; men om kulturen luftades utöver glukostillskott var det ingen förändring i PDC-aktivitet. Sådan enzymaktivering sker inte för alla kolhydrattyper. När jästarter odlas anaerobt på glykosider som ger Kluyver-effekten reduceras PDC-aktiviteten jämfört med glykosider, såsom glukos, som kan metaboliseras anaerobt (Sims och Barnett, 1991). Som ett resultat av deras forskning fann de att PDC-aktivitet kan vara hastighetsbegränsande under anaeroba förhållanden. Detta resultat överensstämmer med van Urk et al. (1989).

PDC är ett substrat-pyruvataktiverat enzym (Hubner et al., 1978; Hohmann, 1997), som också allosteriskt hämmas av oorganiskt fosfat (Boiteux och Hess, 1970). Boiteux och Hess rapporterade en ökning av Michaelis-konstanten (Km) av renad PDC från S. carlsbergensis från 1,3 mm i frånvaro av oorganiskt fosfat till cirka 11 mM i närvaro av 100 mm fosfat. Den hämmande effekten bestämdes vara konkurrenskraftig i naturen, variationen i Km har ingen effekt på enzymets maximala aktivitet. PDC: s känslighet för hämning av fosfat bestämdes vara av samma storleksordning som dess känslighet för aktivering av pyruvat.

Saccharomyces spp. och C. utilis används ofta för produktion av l-PAC; men i tidigt arbete gjordes lite för att jämföra enzymaktiviteter direkt. PDC: erna för S. cerevisiae och C. utilis jämfördes av van Dijken och Scheffers (1986) och van Urk et al. (1989). De bestämde att aktiviteten av PDC från S. cerevisiae var ungefär åtta gånger den för PDC från C. utilis, även om PDC från den förra bestämdes vara känsligare för hämning av fosfat. Med avseende på fosfat visade PDC från C. utilis liknande Km-värden som från S. carlsbergensis, nämligen 3.6 mm i frånvaro av fosfat och 11 mm i närvaro av 100 mm fosfat. Däremot uppvisade PDC från S. cerevisiae Km-värden på 3, 0 mm i frånvaro av fosfat och 48 mm i närvaro av 100 mm fosfat. Följaktligen spelar tillgängligheten av fosfat en viktig roll i aktiviteten hos PDC och därmed PDC-produktivitet. En kombination av reduktion i cytosolisk koncentration av fosfat och ökade pyruvatkoncentrationer föreslogs av van Urk et al. (1989) som bidragande faktorer till ökad PDC-aktivitet efter att ha pulserat kulturen med glukos. Processen som används av Oliver et al. (1997) involverade pulserande med melass halvvägs genom jäsningen, varför en liknande ökning av PDC-aktiviteten troligen skulle ha resulterat.

betydande arbete har utförts av Rogers och medarbetare (Chow et al., 1995; Shin och Rogers, 1996a; Rogers et al., 1997) för att utvärdera kinetiken för PDC från C. utilis i både renad form och i hela celler. De registrerade PDC-aktiviteter av 0.85-0.9 U/mg protein för hel, stationär fas biomassa efter tillväxt i batchkultur. Efter partiell rening, Chow et al. (1995) registrerade en ökning av PDC-aktivitet till 4,8 u/mg protein, vilket var jämförbart med kommersiellt erhållet PDC. Pohl (1997) föreslår att en specifik aktivitet i intervallet 45-60 U/mg kan uppnås för PDC renad från jäst och växter.

Rogers et al. (1997) rapporterade ett antal kinetiska parametrar för renad PDC från C. utilis. Kilometervärdena för bensaldehyd och pyruvat var 42 mm (4 kg C, pH 7,0) respektive 2,2 mm (25 kg C, pH 6,0), med koncentrationer över 10 mm pyruvat som krävs för att ge mättnadsbetingelser. Inhiberingskonstanten (Ki) för acetaldehyd var ungefär 20 mm, medan substrathämning var uppenbar vid bensaldehydkoncentrationer över 180 mm (19,1 g/l).

Chow et al. (1995) genomförde studier för att bestämma kinetiken för deaktivering av PDC med bensaldehyd. De bestämde att deaktiveringen följde första ordningens kinetik för bensaldehyd; svaret var emellertid inte linjärt relaterat till tiden för bensaldehydkoncentrationer mellan 100 och 300 mm.

i mycket av arbetet med produktion av l-PAC har PDC visat sig inte vara den faktor som begränsar l-PAC-produktionen (Vojtisek och Netrval, 1982; Shin och Rogers, 1996a; Tripathi et al., 1997) eftersom viss PDC-aktivitet förblev i slutet av jäsningarna. Snarare fann både Tripathi och medarbetare (1997) och Vojtisek och Netrval (1982) att låg pyruvatkoncentration i medelbegränsade utbyten. Glykolytiska enzymer var inblandade som potentiellt hastighetsbegränsande av både Tripathi och medarbetare, och Nikolova och Ward (1991).

baserat på informationen ovan, villkoren som används av Oliver et al. (1997) (se Avsnitt 4) verkar vara mycket gynnsamt för produktionen av l-PAC. Pyruvat finns i betydande mängder och enligt Hohmann (1997) är kapaciteten för pyruvatdehydrogenas begränsad jämfört med PDC, vilket begränsar metabolismen av pyruvat via den enda alternativa vägen. Vidare kompletteras biomassan med kolhydrat i kombination med minskad luftning. Arbetet med Sims och Barnett (1991) och Sims et al. (1991) indikerar att kombinationen av dessa två förhållanden bidrar till induktion av PDC.