2.2 Pyruvát Dekarboxylázu a Poskytování Podkladů

, Jak je popsáno výše, PDC je enzym zodpovědný za produkci l-PAC. PDC se obvykle vyskytuje jako dimery nebo tetramery, přičemž aktivní HOLOENZYM PDC obecně existuje jako tetramer, zatímco apoenzym existuje jako dimer (Pohl, 1997). Existence dimerových a tetramerových forem je závislá na pH. U kvasinek bylo hlášeno, že PDC existuje pouze jako tetramer v rozmezí pH 5,5-6.5, jako oba tetramery a dimery při hodnotách pH až 9,5 a dimery pouze při pH > 9,5 (Pohl, 1997). Hohmann (1997) však ohlásil existenci PDC pouze ve formě dimerů při pH 8, 4. PDC od Z. mobilis bylo zjištěno, že existuje pouze ve formě tetramerů (Pohl, 1997). Zatímco se dříve myslelo, že podjednotky PDC mají různá složení ,nyní je známo, že jsou identické (Hohmann, 1997).

celkem šest PDC geny byly identifikovány v Saccharomyces cerevisiae, z nichž tři jsou strukturální geny (PDC1, PDC5 a PDC6) a zbývající tři jsou považovány za geny týkající se výraz PDC (PDC2, PDC3, PDC4) (Flikweert et al., 1996; Hohmann, 1997; Pohl, 1997; ter Schure et al., 1998). Jeden strukturální gen kódující PDC byl identifikován v Z. mobilis (Pohl, 1997). I když se zdá, že většina práce v této oblasti byla provedena na S. cerevisiae, geny pro PDC byly identifikovány u řady druhů kvasinek, bez Candida utilis. Flikweert a spolupracovníky provedla studie s cílem posoudit roli jednotlivých izoenzymů v celkové PDC činnosti, a zjistil, že exprese jednotlivých izoenzymů v S. cerevisiae liší. Pomocí dávkové kultury s buď ethanol nebo glukózy jako uhlík substrátu, PDC1 byl vyjádřen constitutively zatímco PDC5 byl vyvolán v přítomnosti glukózy. PDC6 byl přítomen na nevýznamných úrovních. Tyto nálezy byly ozvěnou v recenzi na pyruvát decarboxylases podle Hohmann (1997), kteří uvedli, že pouze PDC1 a PDC5 hraje zřejmou roli v cukru katabolismu, s 80-90% a 10-20% z celkového počtu PDC činnost přičítány tyto dva geny, respektive pro glukózu-pěstované biomasy.

kromě výroby acetoin, S. cerevisiae PDC bylo zjištěno, že být zapojen do výroby přiboudlina olejů, které jsou chuťově sloučeniny přítomen v alkoholických nápojů a chleba. Fuselové oleje se vyrábějí dekarboxylací 2-oxo kyselin s rozvětveným řetězcem, odvozených od aromatických aminokyselin. Produkty jsou pak dehydrogenovány alkoholdehydrogenázou (ADH). Aktivita PDC s 2-oxo kyselinami je významně nižší než u pyruvátu (ter Schure et al ., 1998). Výroba nových analogů aldehydu je popsána dále v této kapitole.

PDC aktivita může být indukována a manipulována jak stupněm provzdušňování dodávaného do kultury, tak volbou sacharidového substrátu v médiu. Aktivita PDC je nutná k umožnění glykolytického toku pouze za anaerobních podmínek; proto by snížení provzdušňování mělo vést k indukci PDC. Oba Sims a spolupracovníci (1991) a Rogers et al. (1997) prokázali, že ke zvýšení aktivity C. utilis PDC dochází, když je koncentrace kyslíku snížena. Taková reakce je velmi přínosná pro výrobu l-PAC. Nicméně, obě skupiny vědci zjistili, že aktivita ADH, zodpovědná za tvorbu nežádoucích vedlejších produktů, přesahuje PDC v anaerobních nebo částečně anaerobní podmínky. Vliv provzdušňovacích podmínek na fyziologii kvasinek je popsán dále v této kapitole.

indukce aktivity PDC zdrojem uhlohydrátů závisí na zúčastněných druzích kvasinek a dodaném zdroji uhlohydrátů. Glukóza je jeden substrát schopný indukovat glykolytické enzymy, zejména PDC. Řada pracovníků prokázala, že přidání glukózy do kultur vede ke zvýšení úrovně aktivity PDC. Maitra a Lobo (1971) zjistili, že přidání glukózy jako pulsu do Saccharomyces spp. kultury vedly ke zvýšení produkce glykolytických enzymů, včetně PDC, po krátkém období zpoždění. Médium použité pro růst neobsahovalo uhlohydráty a jako zdroj uhlíku byl použit acetát. Podobně, Schmitt a Zimmerman (1982) prokázal, 18-násobné zvýšení v PDC činnost S. cerevisiae po glukózy byl přidán do třepací lahve kultury pěstované na etanol jako jediný zdroj sacharidů. Tyto výsledky jsou v souladu s výsledky Harrison (1972)a Sims et al. (1991). Sims a spolupracovníci také prokázali reverzibilní povahu aktivace PDC. Ty ukázaly, že za anaerobních podmínek, kdy zbaven glukózy (odstředěním a promíchání biomasy v glukózu-free medium) PDC činnosti C. utilis byla snížena o 50%. Aktivita PDC byla obnovena přidáním glukózy do média za anaerobních podmínek; pokud však byla kultura provzdušněna kromě suplementace glukózou, nedošlo ke změně aktivity PDC. Taková aktivace enzymu se nevyskytuje u všech typů uhlohydrátů. Když kvasinkové druhy jsou pěstovány anaerobně na glykosidy, které dávají Kluyver efekt, PDC aktivita je snížena ve srovnání s glykosidy, jako je například glukózy, který může být metabolizován anaerobně (Sims a Barnett, 1991). V důsledku jejich výzkumu zjistili, že aktivita PDC může být v anaerobních podmínkách omezující rychlost. Toto zjištění je v souladu s zjištěním van Urk et al. (1989).

PDC je enzym aktivovaný substrátem-pyruvátem (Hubner et al., 1978; Hohmann, 1997), který je také alostericky inhibován anorganickým fosfátem (Boiteux a Hess, 1970). Boiteux a Hess oznámil zvýšení Michaelisova konstanta (Km) purifikovaného PDC od S. carlsbergensis z 1,3 mm v nepřítomnosti anorganického fosfátu přibližně 11 mM v přítomnosti 100 mm fosfátu. Inhibiční účinek byl stanoven jako kompetitivní povahy, přičemž změna Km nemá žádný vliv na maximální aktivitu enzymu. Citlivost PDC na inhibici fosfátem byla stanovena na stejný řád jako jeho citlivost na aktivaci pyruvátem.

Saccharomyces spp. a C. utilis se běžně používají pro výrobu l-PAC; v rané práci však bylo provedeno jen málo pro přímé porovnání enzymových aktivit. PDC s. cerevisiae A C. utilis byly porovnány van Dijken and Scheffers (1986)a van Urk et al. (1989). Zjistili, že aktivita PDC z S. cerevisiae byla přibližně osmkrát vyšší než u PDC z C. utilis, ačkoli PDC z prvního bylo zjištěno, že je citlivější na inhibici fosfátem. S ohledem na fosfát, PDC od C. utilis zobrazeno podobné Km hodnoty, které od S. carlsbergensis, konkrétně 3.6 mm v nepřítomnosti fosfátu a 11 mm v přítomnosti 100 mm fosfátu. V kontrastu, PDC od S. cerevisiae vystavených Km hodnoty 3,0 mm v nepřítomnosti fosfátů a 48 mm v přítomnosti 100 mm fosfátu. V důsledku toho hraje dostupnost fosfátů důležitou roli v aktivitě PDC, a tím i produktivitě PDC. Van Urk et al navrhl kombinaci snížení cytosolické koncentrace fosfátu a zvýšení koncentrací pyruvátu. (1989) jako přispívající faktory ke zvýšené aktivitě PDC po pulzování kultury glukózou. Proces používaný Oliver et al. (1997) zahrnovalo pulzování melasou uprostřed fermentace, a proto by pravděpodobně došlo k podobnému zvýšení aktivity PDC.

významná práce byla provedena Rogersem a spolupracovníky (Chow et al., 1995; Shin a Rogers, 1996a; Rogers a kol., 1997) vyhodnotit kinetiku PDC z C. utilis jak v purifikované formě, tak v celých buňkách. Zaznamenali aktivity PDC 0,85-0,9 u / mg proteinu pro celou biomasu ve stacionární fázi po růstu v dávkové kultuře. Po částečném čištění Chow et al. (1995) zaznamenal zvýšení aktivity PDC na 4, 8 U/mg proteinu, což bylo srovnatelné s komerčně získaným PDC. Pohl (1997) naznačuje, že specifická aktivita v rozmezí 45-60 U / mg může být dosažena pro PDC purifikované z kvasinek a rostlin.

Rogers et al. (1997) uvádí řadu kinetických parametrů pro purifikované PDC od C. utilis. Km hodnoty pro benzaldehydu a pyruvát byly 42 mm (4 °C, pH 7.0) a 2,2 mm (25 °C, pH 6,0), koncentrace nad 10 mm pyruvát povinen poskytnout nasycení podmínky. Inhibiční konstanty (Ki) pro acetaldehyd byla přibližně 20 mm, zatímco inhibice substrátem byl patrný u benzaldehydu koncentrace přesahující 180 mm (19.1 g/l).

Chow et al. (1995) provedla studie ke stanovení kinetiky deaktivace PDC benzaldehydem. Zjistili, že deaktivace následovala kinetiku prvního řádu pro benzaldehyd; odpověď však nebyla lineárně spojena s časem pro koncentrace benzaldehydu mezi 100 a 300 mm.

V kolik práce prováděné na výrobu l-PAC, PDC bylo zjištěno, nesmí být faktorem limitujícím l-PAC výroby (Vojtisek a Netrval, 1982; Shin a Rogers, 1996a; Tripathi et al., 1997), protože určitá aktivita PDC zůstala na konci fermentací. Spíše Tripathi a spolupracovníci (1997) a Vojtisek a Netrval (1982)zjistili, že nízká koncentrace pyruvátu ve středně omezených výnosech. Glykolytické enzymy byly zapojeny jako potenciálně omezující rychlost jak Tripathi a spolupracovníky, tak Nikolova a Ward (1991).

na základě výše uvedených informací, podmínky používané Oliver et al. (1997) (viz Oddíl 4) se jeví jako velmi příznivé pro výrobu l-PAC. Pyruvát je přítomný ve významných množstvích a podle Hohmann (1997), kapacita pyruvát dehydrogenázy je omezena ve srovnání s PDC, čímž se omezuje metabolismus pyruvátu pomocí pouze alternativní trasa. Dále je biomasa doplněna uhlohydráty v kombinaci se sníženým provzdušňováním. The work of Sims and Barnett (1991) a Sims et al. (1991) naznačuje, že kombinace těchto dvou podmínek vede k indukci PDC.