2.2 pyruvat Decarboksylase og tilvejebringelse af substrater

som beskrevet ovenfor er PDC ansvarlig for produktionen af l-PAC. PDC findes normalt som enten dimerer eller tetramerer, hvorved det aktive PDC-holoensym generelt eksisterer som en tetramer, mens apoensymet eksisterer som en dimer (Pohl, 1997). Eksistensen af dimer-og tetramer-formerne er pH-afhængig. I gær er PDC rapporteret at eksistere kun som en tetramer i pH–området 5,5-6.5, som både tetramere og dimerer ved pH-værdier op til 9,5 og dimerer kun ved pH > 9,5 (Pohl, 1997). Hohmann (1997) har imidlertid kun rapporteret eksistensen af PDC i form af dimerer ved en pH på 8,4. PDC fra mobilis har vist sig kun at eksistere i form af tetramere (Pohl, 1997). Mens PDC-underenheder tidligere blev antaget at have forskellige kompositioner, er de nu kendt for at være identiske (Hohmann, 1997).

i alt seks PDC-gener er blevet identificeret i Saccharomyces cerevisiae, hvoraf tre er strukturelle gener (PDC1, PDC5 og PDC6), og de resterende tre anses for at være gener relateret til ekspression af PDC (PDC2, PDC3, PDC4)., 1996; Hohmann, 1997; Pohl, 1997; ter Schure et al., 1998). Et enkelt strukturelt gen, der koder for PDC, er blevet identificeret i G. mobilis (Pohl, 1997). Mens størstedelen af arbejdet på dette område ser ud til at være udført på S. cerevisiae, er gener for PDC blevet identificeret i en række gærarter, ikke inklusive Candida utilis. Det er en af de mest almindelige årsager til, at en person er i stand til at få et barn, og at han er i stand til at finde ud af, om han er i stand til at finde en person, der er i stand til at få et barn. Ved anvendelse af batchkultur med enten ethanol eller glucose som carbonsubstrat blev PDC1 udtrykt konstitutivt, mens PDC5 blev induceret i nærvær af glucose. PDC6 var til stede på ubetydelige niveauer. Disse resultater blev gentaget i en gennemgang af pyruvat decarboksylaser af Hohmann (1997), der indikerede, at kun PDC1 og PDC5 spillede en tilsyneladende rolle i sukkerkatabolisme, hvor 80-90% og 10-20% af den samlede PDC-aktivitet tilskrives henholdsvis disse to gener for glucosedyrket biomasse.

ud over produktionen af acetoin har S. cerevisiae PDC vist sig at være involveret i produktionen af fuselolier, som er smagsforbindelser til stede i alkoholholdige drikkevarer og brød. Fuselolier fremstilles ved dekarboksylation af forgrenede 2-okso syrer, afledt af aromatiske aminosyrer. Produkterne dehydrogeneres derefter af alkoholdehydrogenase (ADH). Aktiviteten af PDC med 2-oksosyrerne er signifikant lavere end for pyruvat (ter Schure et al., 1998). Produktion af nye aldehydanaloger diskuteres senere i dette kapitel.

PDC-aktivitet kan induceres og manipuleres både ved den beluftningsgrad, der leveres til kulturen, og ved valget af kulhydratsubstrat i mediet. PDC-aktivitet er kun nødvendig for at muliggøre glykolytisk strømning under anaerobe forhold; derfor bør en reduktion i beluftning resultere i induktion af PDC. Både Sims og kolleger (1991) og Rogers et al. (1997) har vist, at en stigning i C. utilis PDC-aktivitet opstår, når iltkoncentrationen reduceres. Et sådant svar er yderst gavnligt for produktionen af l-PAC. Imidlertid fandt begge grupper af forskere, at aktiviteten af ADH, der er ansvarlig for generering af uønskede biprodukter, overstiger aktiviteten af PDC under anaerobe eller delvist anaerobe forhold. Effekten af beluftningsbetingelser på gærfysiologi diskuteres senere i dette kapitel.

induktion af PDC-aktivitet med kulhydratkilde afhænger af de involverede gærarter og den leverede kulhydratkilde. Glukose er et substrat, der er i stand til at inducere glycolytiske stoffer, især PDC. En række arbejdstagere har vist, at tilsætningen af glukose til kulturer resulterer i en stigning i niveauet af PDC-aktivitet. Maitra og Lobo (1971) fandt, at tilsætningen af glukose som en puls til Saccharomyces spp. cultures resulterede i en stigning i produktionen af glycolytiske stoffer, herunder PDC, efter en kort forsinkelsesperiode. Mediet, der blev brugt til vækst, var kulhydratfrit, og acetat blev brugt som kulstofkilde. Tilsvarende viste Schmitt og Simmerman (1982) en 18 gange stigning i PDC-aktiviteten af S. cerevisiae, efter at glucose blev tilsat til en rystekolbe-kultur dyrket på ethanol som den eneste kulhydratkilde. Disse resultater er i overensstemmelse med Harrison (1972) og Sims et al. (1991). Sims og kolleger demonstrerede også den reversible karakter af PDC-aktivering. De viste, at PDC-aktiviteten af C. utilis under anaerobe forhold, når den blev frataget glukose (ved centrifugering og resuspendering af biomasse i glukosefrit medium) blev reduceret med 50%. PDC-aktivitet blev gendannet ved tilsætning af glukose til mediet under anaerobe betingelser; men hvis kulturen blev luftet ud over glukosetilskud, var der ingen ændring i PDC-aktivitet. En sådan aktivering forekommer ikke for alle kulhydrattyper. Når gærarter dyrkes anaerobt på glycosider, der giver Kluyver-effekten, reduceres PDC-aktiviteten sammenlignet med glycosider, såsom glukose, som kan metaboliseres anaerobt (Sims og Barnett, 1991). Som et resultat af deres forskning fandt de, at PDC-aktivitet kan være hastighedsbegrænsende under anaerobe forhold. Dette fund er i overensstemmelse med van Urk et al. (1989).PDC er et substratpyruvataktiveret (Hubner et al., 1978; Hohmann, 1997), som også allosterisk hæmmes af uorganisk fosfat (1970). En stigning i Michaelis-konstanten (Km) af renset PDC fra S. carlsbergensis fra 1,3 mm i fravær af uorganisk phosphat til ca.11 mM i nærvær af 100 mm phosphat. Den hæmmende virkning blev bestemt til at være konkurrencedygtig, idet variationen i Km ikke havde nogen effekt på den maksimale aktivitet af det aktive stof. PDC ‘ s følsomhed over for inhibering af phosphat blev bestemt til at være af samme størrelsesorden som dens følsomhed over for aktivering af pyruvat.

Saccharomyces spp. og C. utilis er almindeligt anvendt til produktion af l-PAC; i det tidlige arbejde blev der dog ikke gjort meget for at sammenligne aktiviteterne direkte. PDC ‘ erne for S. cerevisiae og C. utilis blev sammenlignet med van Dijken og Scheffers (1986) og van Urk et al. (1989). De bestemte, at aktiviteten af PDC fra S. cerevisiae var ca.otte gange den for PDC fra C. utilis, skønt PDC fra førstnævnte blev bestemt til at være mere følsom over for inhibering af phosphat. Med hensyn til fosfat viste PDC fra C. utilis lignende Km-værdier som fra S. carlsbergensis, nemlig 3.6 mm i fravær af phosphat og 11 mm i nærvær af 100 mm phosphat. I modsætning hertil udviste PDC fra S. cerevisiae Km-værdier på 3,0 mm i fravær af phosphat og 48 mm i nærvær af 100 mm phosphat. Derfor spiller tilgængeligheden af fosfat en vigtig rolle i aktiviteten af PDC og dermed PDC-produktivitet. En kombination af reduktion i den cytosoliske koncentration af phosphat og øgede pyruvatkoncentrationer blev foreslået af van Urk et al. (1989) som medvirkende faktorer til øget PDC-aktivitet efter at have pulseret kulturen med glukose. Processen anvendt af Oliver et al. (1997) involverede pulserende med melasse midtvejs gennem gæringen, hvorfor en lignende stigning i PDC-aktivitet sandsynligvis ville have resulteret.

Der er udført et betydeligt arbejde af Rogers og kolleger., 1995; Shin og Rogers, 1996a; Rogers et al., 1997) at evaluere kinetikken af PDC fra C. utilis i både oprenset form og i hele celler. De registrerede PDC-aktiviteter på 0,85-0,9 u/mg protein til hel, stationær fase biomasse efter vækst i batchkultur. Efter delvis oprensning, Chov et al. (1995) registrerede en stigning i PDC-aktivitet til 4,8 E/mg protein, hvilket var sammenligneligt med kommercielt opnået PDC. Pohl (1997) antyder, at en specifik aktivitet i området 45-60 U/mg kan opnås for PDC oprenset fra gær og planter.

Rogers et al. (1997) rapporterede en række kinetiske parametre for renset PDC fra C. utilis. Km-værdierne for pyruvat og pyruvat var henholdsvis 42 mm (4 liter C, pH 7,0) og 2,2 mm (25 liter C, pH 6,0) med koncentrationer på over 10 mm pyruvat, der kræves for at give mætningsbetingelser. 20 mm, mens substratinhibering var tydelig ved koncentrationer på over 180 mm (19,1 g/l).

Chu et al. (1995) foretog undersøgelser for at bestemme kinetikken for deaktivering af PDC med benaldehyd. De fastslog, at deaktiveringen fulgte førsteordens kinetik for bensaldehyd; responsen var imidlertid ikke lineært relateret til tiden for bensaldehydkoncentrationer mellem 100 og 300 mm.

i meget af arbejdet med produktion af l-PAC har PDC vist sig ikke at være den faktorbegrænsende l-PAC-produktion (Vojtisek og Netrval, 1982; Shin og Rogers, 1996a; Tripathi et al., 1997), da nogle PDC-aktiviteter forblev i slutningen af fermenteringerne. Snarere fandt både Tripathi og kolleger (1997) og Vojtisek og Netrval (1982), at lav pyruvatkoncentration i de mellemstore begrænsede udbytter. Som potentielt hastighedsbegrænsende af både Tripathi og kolleger og Nikolova og Afdeling (1991).

baseret på ovenstående oplysninger, de betingelser, der anvendes af Oliver et al. (1997) (se Afsnit 4) synes at være meget befordrende for produktionen af L-PAC. Pyruvat er til stede i betydelige mængder, og ifølge Hohmann (1997) er kapaciteten af pyruvatdehydrogenase begrænset sammenlignet med PDC, hvorved metabolisme af pyruvat begrænses via den eneste alternative vej. Endvidere suppleres biomassen med kulhydrat i kombination med reduceret beluftning. Arbejdet med Sims og Barnett (1991) og Sims et al. (1991) angiver, at kombinationen af disse to betingelser er befordrende for induktion af PDC.