2.2 Pyruvatdecarboxylase und Bereitstellung von Substraten

Wie oben beschrieben, ist PDC das Enzym, das für die Produktion von l-PAC verantwortlich ist. PDC existiert normalerweise entweder als Dimere oder Tetramere, wobei das aktive PDC-Holoenzym im Allgemeinen als Tetramer existiert, während das Apoenzym als Dimer existiert (Pohl, 1997). Die Existenz der Dimer- und Tetramerformen ist pH-abhängig. In Hefe wurde berichtet, dass PDC nur als Tetramer im pH–Bereich 5,5-6 existiert.5, sowohl als Tetramere als auch als Dimere bei pH-Werten bis 9,5 und Dimere nur bei pH > 9,5 (Pohl, 1997). Hohmann (1997) berichtete jedoch über die Existenz von PDC nur in Form von Dimeren bei einem pH-Wert von 8,4. PDC aus Z. mobilis existiert nur in Form von Tetrameren (Pohl, 1997). Während früher angenommen wurde, dass PDC-Untereinheiten unterschiedliche Zusammensetzungen haben, ist jetzt bekannt, dass sie identisch sind (Hohmann, 1997).

In Saccharomyces cerevisiae wurden insgesamt sechs PDC-Gene identifiziert, von denen drei Strukturgene (PDC1, PDC5 und PDC6) sind und die restlichen drei als Gene gelten, die mit der Expression von PDC zusammenhängen (PDC2, PDC3, PDC4) (Flikweert et al., 1996; Hohmann, 1997; Pohl, 1997; ter Schure et al., 1998). Ein einzelnes strukturelles Gen, das für PDC kodiert, wurde in Z. mobilis (Pohl, 1997) identifiziert. Während der Großteil der Arbeiten in diesem Bereich an S. cerevisiae durchgeführt worden zu sein scheint, wurden Gene für PDC in einer Reihe von Hefearten identifiziert, ohne Candida utilis. Flikweert und Mitarbeiter führten Studien durch, um die Rolle jedes der Isoenzyme in der gesamten PDC-Aktivität zu bewerten, und fanden heraus, dass sich die Expression jedes der Isoenzyme in S. cerevisiae unterschied. Unter Verwendung einer Chargenkultur mit Ethanol oder Glucose als Kohlenstoffsubstrat wurde PDC1 konstitutiv exprimiert, während PDC5 in Gegenwart von Glucose induziert wurde. PDC6 war in unbedeutenden Mengen vorhanden. Diese Ergebnisse wurden in einer Übersicht über Pyruvatdecarboxylasen von Hohmann (1997) wiederholt, die darauf hinwies, dass nur PDC1 und PDC5 eine offensichtliche Rolle beim Zuckerkatabolismus spielten, wobei 80-90% und 10-20% der gesamten PDC-Aktivität diesen beiden Genen für Glucose-gewachsene Biomasse zugeschrieben wurden.

Neben der Herstellung von Acetoin wurde festgestellt, dass S. cerevisiae PDC an der Herstellung von Fuselölen beteiligt ist, bei denen es sich um Aromastoffe handelt, die in alkoholischen Getränken und Brot enthalten sind. Fuselöle werden durch Decarboxylierung von verzweigtkettigen 2-Oxosäuren hergestellt, die von aromatischen Aminosäuren abgeleitet sind. Die Produkte werden dann durch Alkoholdehydrogenase (ADH) dehydriert. Die Aktivität von PDC mit den 2-Oxosäuren ist signifikant geringer als bei Pyruvat (ter Schure et al., 1998). Die Herstellung neuer Aldehydanaloga wird später in diesem Kapitel diskutiert.

Die PDC-Aktivität kann sowohl durch den Belüftungsgrad der Kultur als auch durch die Wahl des Kohlenhydratsubstrats im Medium induziert und manipuliert werden. Die PDC-Aktivität ist erforderlich, um den glykolytischen Fluss nur unter anaeroben Bedingungen zu ermöglichen; Daher sollte eine Verringerung der Belüftung zur Induktion von PDC führen. Sowohl Sims als auch Mitarbeiter (1991) und Rogers et al. (1997) haben gezeigt, dass eine Zunahme der PDC-Aktivität von C. utilis auftritt, wenn die Sauerstoffkonzentration verringert wird. Eine solche Reaktion ist sehr vorteilhaft für die Produktion von l-PAC. Beide Forschergruppen fanden jedoch heraus, dass die Aktivität von ADH, die für die Erzeugung unerwünschter Nebenprodukte verantwortlich ist, die von PDC unter anaeroben oder teilweise anaeroben Bedingungen übersteigt. Die Auswirkung von Belüftungsbedingungen auf die Hefephysiologie wird später in diesem Kapitel erörtert.

Die Induktion der PDC-Aktivität durch die Kohlenhydratquelle ist abhängig von der beteiligten Hefespezies und der zugeführten Kohlenhydratquelle. Glucose ist ein Substrat, das glykolytische Enzyme induzieren kann, insbesondere PDC. Eine Reihe von Arbeitern hat gezeigt, dass die Zugabe von Glucose zu Kulturen zu einer Erhöhung der PDC-Aktivität führt. Maitra und Lobo (1971) fanden heraus, dass die Zugabe von Glucose als Impuls zu Saccharomyces spp. kulturen führten nach einer kurzen Verzögerungsperiode zu einem Anstieg der Produktion von glykolytischen Enzymen, einschließlich PDC. Das für das Wachstum verwendete Medium war kohlenhydratfrei und Acetat wurde als Kohlenstoffquelle verwendet. In ähnlicher Weise zeigten Schmitt und Zimmerman (1982) eine 18-fache Zunahme der PDC-Aktivität von S. cerevisiae, nachdem Glucose zu einer Schüttelkolbenkultur gegeben wurde, die auf Ethanol als einzige Kohlenhydratquelle gezüchtet wurde. Diese Ergebnisse stimmen mit denen von Harrison (1972) und Sims et al. überein. (1991). Sims und Mitarbeiter zeigten auch die reversible Natur der PDC-Aktivierung. Sie zeigten, dass unter anaeroben Bedingungen bei Entzug von Glucose (durch Zentrifugieren und Resuspendieren von Biomasse in glucosefreiem Medium) die PDC-Aktivität von C. utilis um 50% reduziert wurde. Die PDC-Aktivität wurde durch Zugabe von Glucose zu dem Medium unter anaeroben Bedingungen wiederhergestellt; Wenn jedoch die Kultur zusätzlich zur Glucose-Supplementierung belüftet wurde, gab es keine Änderung der PDC-Aktivität. Eine solche Enzymaktivierung tritt nicht bei allen Kohlenhydrattypen auf. Wenn Hefearten anaerob auf Glykosiden gezüchtet werden, die den Kluyver-Effekt ergeben, ist die PDC-Aktivität im Vergleich zu Glykosiden wie Glucose, die anaerob metabolisiert werden können, reduziert (Sims und Barnett, 1991). Als Ergebnis ihrer Forschung fanden sie heraus, dass die PDC-Aktivität unter anaeroben Bedingungen ratenbegrenzend sein kann. Dieser Befund stimmt mit dem von van Urk et al. (1989).

PDC ist ein Substrat-Pyruvat-aktiviertes Enzym (Hubner et al., 1978; Hohmann, 1997), die ebenfalls durch anorganisches Phosphat allosterisch gehemmt wird (Boiteux und Hess, 1970). Boiteux und Hess berichteten über einen Anstieg der Michaelis-Konstante (Km) von gereinigtem PDC aus S. carlsbergensis von 1,3 mm in Abwesenheit von anorganischem Phosphat auf etwa 11 mM in Gegenwart von 100 mm Phosphat. Die inhibitorische Wirkung wurde als kompetitiv bestimmt, wobei die Variation in Km keinen Einfluss auf die maximale Aktivität des Enzyms hatte. Die Empfindlichkeit von PDC zur Hemmung durch Phosphat wurde in der gleichen Größenordnung wie seine Empfindlichkeit zur Aktivierung durch Pyruvat bestimmt.

Saccharomyces spp. und C. utilis werden üblicherweise zur Herstellung von L-PAC verwendet; in frühen Arbeiten wurde jedoch wenig getan, um Enzymaktivitäten direkt zu vergleichen. Die PDCs von S. cerevisiae und C. utilis wurden von van Dijken und Scheffers (1986) und van Urk et al. (1989). Sie stellten fest, dass die Aktivität von PDC aus S. cerevisiae ungefähr achtmal so hoch war wie die von PDC aus C. utilis, obwohl festgestellt wurde, dass das PDC aus ersterem empfindlicher auf eine Hemmung durch Phosphat reagiert. In Bezug auf Phosphat zeigte die PDC von C. utilis ähnliche Km-Werte wie die von S. carlsbergensis, nämlich 3.6 mm in Abwesenheit von Phosphat und 11 mm in Gegenwart von 100 mm Phosphat. Im Gegensatz dazu zeigte PDC aus S. cerevisiae Km-Werte von 3,0 mm in Abwesenheit von Phosphat und 48 mm in Gegenwart von 100 mm Phosphat. Folglich spielt die Verfügbarkeit von Phosphat eine wichtige Rolle für die Aktivität von PDC und damit für die Produktivität von PDC. Eine Kombination aus Verringerung der cytosolischen Phosphatkonzentration und erhöhten Pyruvatkonzentrationen wurde von van Urk et al. (1989) als beitragende Faktoren zu einer erhöhten PDC-Aktivität nach Pulsieren der Kultur mit Glucose. Das von Oliver et al. (1997) beteiligt Pulsieren mit Melasse in der Mitte der Fermentation, daher würde eine ähnliche Zunahme der PDC-Aktivität höchstwahrscheinlich geführt haben.

Bedeutende Arbeit wurde von Rogers und Mitarbeitern (Chow et al., 1995; Shin und Rogers, 1996a; Rogers et al., 1997), um die Kinetik von PDC aus C. utilis sowohl in gereinigter Form als auch in ganzen Zellen zu bewerten. Sie registrierten PDC-Aktivitäten von 0,85-0,9 U / mg Protein für ganze Biomasse in stationärer Phase nach dem Wachstum in Batch-Kultur. Nach teilweiser Reinigung, Chow et al. (1995) verzeichneten einen Anstieg der PDC-Aktivität auf 4,8 U / mg Protein, was mit kommerziell erhaltenem PDC vergleichbar war. Pohl (1997) schlägt vor, dass eine spezifische Aktivität im Bereich von 45-60 U / mg für aus Hefen und Pflanzen gereinigtes PDC erreicht werden kann.

Rogers et al. (1997) berichteten über eine Reihe kinetischer Parameter für gereinigtes PDC aus C. utilis. Die Km-Werte für Benzaldehyd und Pyruvat betrugen 42 mm (4°C, pH 7,0) bzw. 2,2 mm (25°C, pH 6,0), wobei Konzentrationen von mehr als 10 mm Pyruvat für Sättigungsbedingungen erforderlich waren. Die Hemmkonstante (Ki) für Acetaldehyd betrug ca.20 mm, während die Substrathemmung bei Benzaldehydkonzentrationen über 180 mm (19,1 g/l) erkennbar war.

Chow et al. (1995) führten Studien durch, um die Kinetik der Deaktivierung von PDC durch Benzaldehyd zu bestimmen. Sie stellten fest, dass die Deaktivierung der Kinetik erster Ordnung für Benzaldehyd folgte; Die Reaktion war jedoch nicht linear mit der Zeit für Benzaldehydkonzentrationen zwischen 100 und 300 mm verbunden.

In einem Großteil der Arbeiten zur Produktion von l-PAC wurde festgestellt, dass PDC nicht der Faktor ist, der die L-PAC-Produktion begrenzt (Vojtisek und Netrval, 1982; Shin und Rogers, 1996a; Tripathi et al., 1997), da am Ende der Fermentationen eine gewisse PDC-Aktivität verblieb. Vielmehr stellten sowohl Tripathi und Mitarbeiter (1997) als auch Vojtisek und Netrval (1982) fest, dass eine niedrige Pyruvatkonzentration im Medium die Ausbeuten begrenzte. Glykolytische Enzyme wurden sowohl von Tripathi als auch von Mitarbeitern und Nikolova und Ward (1991) als potenziell ratenbegrenzend eingestuft.

Basierend auf den obigen Informationen wurden die von Oliver et al. (1997) (siehe Abschnitt 4) scheinen der Produktion von L-PAC sehr förderlich zu sein. Pyruvat ist in signifikanten Mengen vorhanden und nach Hohmann (1997) ist die Kapazität der Pyruvatdehydrogenase im Vergleich zu der von PDC begrenzt, wodurch der Metabolismus von Pyruvat über den einzigen alternativen Weg eingeschränkt wird. Ferner wird die Biomasse mit Kohlenhydraten in Kombination mit reduzierter Belüftung ergänzt. Die Arbeit von Sims und Barnett (1991) und Sims et al. (1991) zeigt an, dass die Kombination dieser beiden Bedingungen der Induktion von PDC förderlich ist.