2.2 Pyruvate Décarboxylase et fourniture de substrats

Comme décrit ci-dessus, la PDC est l’enzyme responsable de la production de l-PAC. On trouve généralement que le PDC existe sous forme de dimères ou de tétramères, l’holoenzyme du PDC actif étant généralement un tétramère, tandis que l’apoenzyme existe sous forme de dimère (Pohl, 1997). L’existence des formes dimères et tétramères dépend du pH. Dans la levure, le PDC n’existe que sous la forme d’un tétramère dont le pH est compris entre 5,5 et 6.5, comme tétramères et dimères à des valeurs de pH allant jusqu’à 9,5, et dimères uniquement à pH > 9,5 (Pohl, 1997). Cependant, Hohmann (1997) a signalé l’existence du PDC uniquement sous forme de dimères à un pH de 8,4. Le PDC de Z. mobilis n’existe que sous forme de tétramères (Pohl, 1997). Alors que l’on pensait auparavant que les sous-unités PDC avaient des compositions différentes, on sait maintenant qu’elles sont identiques (Hohmann, 1997).

Un total de six gènes PDC a été identifié chez Saccharomyces cerevisiae, dont trois sont des gènes structuraux (PDC1, PDC5 et PDC6) et les trois autres sont considérés comme des gènes liés à l’expression de PDC (PDC2, PDC3, PDC4) (Flikweert et al., 1996; Hohmann, 1997; Pohl, 1997; ter Schure et coll., 1998). Un seul gène structural codant pour le PDC a été identifié chez Z. mobilis (Pohl, 1997). Bien que la majorité des travaux dans ce domaine semblent avoir été effectués sur S. cerevisiae, des gènes de PDC ont été identifiés chez un certain nombre d’espèces de levures, à l’exclusion de Candida utilis. Flikweert et ses collègues ont entrepris des études pour évaluer le rôle de chacune des isoenzymes dans l’activité globale du PDC et ont constaté que l’expression de chacune des isoenzymes chez S. cerevisiae différait. En utilisant une culture par lots avec de l’éthanol ou du glucose comme substrat carboné, PDC1 a été exprimé de manière constitutive tandis que PDC5 a été induit en présence de glucose. Le PDC6 était présent à des niveaux insignifiants. Ces résultats ont été repris dans une revue sur les pyruvates décarboxylases par Hohmann (1997), qui a indiqué que seuls le PDC1 et le PDC5 jouaient un rôle apparent dans le catabolisme du sucre, 80 à 90% et 10 à 20% de l’activité totale du PDC étant attribués à ces deux gènes, respectivement, pour la biomasse cultivée en glucose.

En plus de la production d’acétoïne, S. cerevisiae PDC a été impliqué dans la production d’huiles de fusel, qui sont des composés aromatiques présents dans les boissons alcoolisées et le pain. Les huiles de fusel sont produites par décarboxylation d’acides 2-oxo à chaîne ramifiée, dérivés d’acides aminés aromatiques. Les produits sont ensuite déshydrogénés par l’alcool déshydrogénase (ADH). L’activité du PDC avec les acides 2-oxo est significativement plus faible que pour le pyruvate (ter Schure et al., 1998). La production de nouveaux analogues aldéhydiques est discutée plus loin dans ce chapitre.

L’activité PDC peut être induite et manipulée à la fois par le degré d’aération apporté à la culture et par le choix du substrat glucidique dans le milieu. L’activité PDC est nécessaire pour permettre le flux glycolytique uniquement dans des conditions anaérobies; par conséquent, une réduction de l’aération devrait entraîner l’induction de PDC. Sims et ses collègues (1991) et Rogers et coll. (1997) ont démontré qu’une augmentation de l’activité PDC de C. utilis se produit lorsque la concentration en oxygène est réduite. Une telle réponse est très bénéfique pour la production de l-PAC. Cependant, les deux groupes de chercheurs ont constaté que l’activité de l’ADH, responsable de la génération de sous-produits indésirables, dépasse celle du PDC dans des conditions anaérobies ou partiellement anaérobies. L’effet des conditions d’aération sur la physiologie de la levure est discuté plus loin dans ce chapitre.

L’induction de l’activité PDC par la source de glucides dépend de l’espèce de levure impliquée et de la source de glucides fournie. Le glucose est un substrat capable d’induire des enzymes glycolytiques, en particulier la PDC. Un certain nombre de travailleurs ont démontré que l’ajout de glucose dans les cultures entraîne une augmentation du niveau d’activité du PDC. Maitra et Lobo (1971) ont constaté que l’addition de glucose sous forme de pouls à Saccharomyces spp. les cultures ont entraîné une augmentation de la production d’enzymes glycolytiques, y compris le PDC, après une courte période de latence. Le milieu utilisé pour la croissance était sans glucides et l’acétate était utilisé comme source de carbone. De même, Schmitt et Zimmerman (1982) ont démontré une augmentation de 18 fois de l’activité PDC de S. cerevisiae après l’ajout de glucose dans une culture en flacon agité cultivée avec de l’éthanol comme seule source de glucides. Ces résultats sont en accord avec ceux de Harrison (1972) et Sims et al. (1991). Sims et ses collègues ont également démontré la nature réversible de l’activation du PDC. Ils ont montré que, en conditions anaérobies, lorsqu’il est privé de glucose (par centrifugation et remise en suspension de la biomasse en milieu exempt de glucose), l’activité PDC de C. utilis était réduite de 50%. L’activité PDC a été rétablie par l’ajout de glucose dans le milieu en conditions anaérobies; cependant, si la culture était aérée en plus de la supplémentation en glucose, il n’y avait pas de changement dans l’activité PDC. Une telle activation enzymatique ne se produit pas pour tous les types de glucides. Lorsque des espèces de levures sont cultivées en anaérobie sur des glycosides qui donnent l’effet Kluyver, l’activité de la PDC est réduite par rapport aux glycosides, tels que le glucose, qui peuvent être métabolisés en anaérobie (Sims et Barnett, 1991). À la suite de leurs recherches, ils ont constaté que l’activité PDC peut limiter le taux dans des conditions anaérobies. Cette conclusion est en accord avec celle de van Urk et coll. (1989).

Le PDC est une enzyme activée par le substrat-pyruvate (Hubner et al., 1978; Hohmann, 1997), qui est également inhibée allostériquement par le phosphate inorganique (Boiteux et Hess, 1970). Boiteux et Hess ont signalé une augmentation de la constante de Michaelis (Km) du PDC purifié de S. carlsbergensis de 1,3 mm en l’absence de phosphate inorganique à environ 11 mM en présence de phosphate de 100 mm. On a déterminé que l’effet inhibiteur était de nature compétitive, la variation du Km n’ayant aucun effet sur l’activité maximale de l’enzyme. On a déterminé que la sensibilité du PDC à l’inhibition par le phosphate était du même ordre de grandeur que sa sensibilité à l’activation par le pyruvate.

Saccharomyces spp. et C. utilis sont couramment utilisés pour la production de l-PAC; cependant, dans les premiers travaux, peu de choses ont été faites pour comparer directement les activités enzymatiques. Les PDC de S. cerevisiae et de C. utilis ont été comparés par van Dijken et Scheffers (1986), et van Urk et al. (1989). Ils ont déterminé que l’activité du PDC de S. cerevisiae était environ huit fois supérieure à celle du PDC de C. utilis, bien que le PDC du premier ait été déterminé comme étant plus sensible à l’inhibition par le phosphate. En ce qui concerne le phosphate, le PDC de C. utilis affichait des valeurs Km similaires à celles de S. carlsbergensis, à savoir 3.6 mm en l’absence de phosphate, et 11 mm en présence de 100 mm de phosphate. En revanche, le PDC de S. cerevisiae présente des valeurs Km de 3,0 mm en l’absence de phosphate et de 48 mm en présence de phosphate de 100 mm. Par conséquent, la disponibilité du phosphate joue un rôle important dans l’activité du PDC et donc dans la productivité du PDC. Une combinaison de réduction de la concentration cytosolique de phosphate et d’augmentation des concentrations de pyruvate a été proposée par van Urk et al. (1989) en tant que facteurs contribuant à l’augmentation de l’activité PDC après pulsation de la culture avec du glucose. Le procédé utilisé par Oliver et al. (1997) impliquaient des pulsations avec de la mélasse au milieu de la fermentation, d’où une augmentation similaire de l’activité PDC aurait très probablement résulté.

Des travaux importants ont été entrepris par Rogers et ses collègues (Chow et al., 1995; Shin et Rogers, 1996a; Rogers et coll., 1997) pour évaluer la cinétique du PDC de C. utilis sous forme purifiée et dans des cellules entières. Ils ont enregistré des activités PDC de 0,85 à 0,9 U / mg de protéines pour la biomasse entière en phase stationnaire après croissance en culture par lots. Après purification partielle, Chow et al. (1995) ont enregistré une augmentation de l’activité de la PDC à 4,8 U/mg de protéine, ce qui était comparable à la PDC obtenue dans le commerce. Pohl (1997) suggère qu’une activité spécifique de l’ordre de 45 à 60 U / mg peut être atteinte pour le PDC purifié à partir de levures et de plantes.

Rogers et coll. (1997) ont rapporté un certain nombre de paramètres cinétiques pour le PDC purifié de C. utilis. Les valeurs Km pour le benzaldéhyde et le pyruvate étaient respectivement de 42 mm (4 °C, pH 7,0) et de 2,2 mm (25 °C, pH 6,0), avec des concentrations supérieures à 10 mm de pyruvate nécessaires pour obtenir des conditions de saturation. La constante d’inhibition (Ki) de l’acétaldéhyde était d’environ 20 mm, tandis que l’inhibition du substrat était évidente à des concentrations de benzaldéhyde supérieures à 180 mm (19,1 g/l).

Chow et coll. (1995) ont entrepris des études pour déterminer la cinétique de désactivation du PDC par le benzaldéhyde. Ils ont déterminé que la désactivation suivait la cinétique du premier ordre pour le benzaldéhyde; cependant, la réponse n’était pas linéairement liée au temps pour des concentrations de benzaldéhyde comprises entre 100 et 300 mm.

Dans la plupart des travaux entrepris sur la production de l-PAC, le PDC n’est pas le facteur limitant la production de l-PAC (Vojtisek et Netrval, 1982; Shin et Rogers, 1996a; Tripathi et al., 1997) étant donné qu’une certaine activité PDC est restée à la fin des fermentations. Tripathi et ses collègues (1997) et Vojtisek et Netrval (1982) ont plutôt constaté que la faible concentration de pyruvate dans le milieu limitait les rendements. Tripathi et ses collègues, ainsi que Nikolova et Ward (1991) ont suggéré que les enzymes glycolytiques limitaient potentiellement le débit.

Sur la base des informations ci-dessus, les conditions utilisées par Oliver et al. (1997) (voir la section 4) semblent être très propices à la production de l-PAC. Le pyruvate est présent en quantités importantes et, selon Hohmann (1997), la capacité de la pyruvate déshydrogénase est limitée par rapport à celle de la PDC, limitant ainsi le métabolisme du pyruvate par la seule voie alternative. De plus, la biomasse est complétée par des glucides en combinaison avec une aération réduite. Les travaux de Sims et Barnett (1991) et Sims et al. (1991) indiquent que la combinaison de ces deux conditions est propice à l’induction du PDC.