2.2 piruvát-dekarboxiláz és szubsztrátok biztosítása

a fent leírtak szerint a PDC az L-PAC termeléséért felelős enzim. A PDC általában dimerként vagy tetramerként létezik, ahol az aktív PDC holoenzim általában tetramer, míg az apoenzim dimerként létezik (Pohl, 1997). A dimer és tetramer formák létezése pH-függő. Élesztőben a PDC csak tetramer formájában létezik a pH-tartományban 5,5-6.5, mint mind a tetramerek, mind a dimerek 9,5-ig terjedő pH-értéken, és csak pH-értéken dimerek > 9,5 (Pohl, 1997). Hohmann (1997) azonban arról számolt be, hogy a PDC csak dimerek formájában létezik 8,4 pH-n. Megállapították, hogy a Z. mobilis PDC csak tetramerek formájában létezik (Pohl, 1997). Míg korábban úgy gondolták, hogy a PDC alegységek összetétele eltérő, ma már ismert, hogy azonosak (Hohmann, 1997).

összesen hat PDC gént azonosítottak a Saccharomyces cerevisiae – ben, amelyek közül három strukturális gén (PDC1, PDC5 és PDC6), a fennmaradó három pedig a PDC expressziójához kapcsolódó génnek tekinthető (PDC2, PDC3, PDC4) (Flikweert et al., 1996; Hohmann, 1997; Pohl, 1997; ter Schure et al., 1998). A PDC-t kódoló egyetlen szerkezeti gént azonosítottak Z. mobilis (Pohl, 1997). Míg úgy tűnik, hogy ezen a területen a munka nagy részét S. cerevisiae-n végezték, a PDC génjeit számos élesztőfajban azonosították, a Candida utilis kivételével. Flikweert és munkatársai vizsgálatokat végeztek, hogy felmérjék az egyes izoenzimek szerepét a teljes PDC aktivitásban, és megállapították, hogy az egyes izoenzimek expressziója a S. cerevisiae-ben eltérő volt. A kötegelt tenyészetet etanollal vagy glükózzal szén szubsztrátként alkalmazva a PDC1 konstitutívan expresszálódott, míg a PDC5 glükóz jelenlétében indukálódott. A PDC6 jelentéktelen mértékben volt jelen. Ezeket a megállapításokat Hohmann (1997) a piruvát-dekarboxilázok áttekintésében visszhangozta, aki jelezte, hogy csak a pdc1 és a PDC5 játszott nyilvánvaló szerepet a cukor katabolizmusában, a teljes PDC aktivitás 80-90% – át, illetve 10-20% – át tulajdonítják ennek a két génnek a glükózban termesztett biomasszához.

az acetoin előállításán kívül a S. cerevisiae PDC-ről megállapították, hogy részt vesz a törzsolajok előállításában, amelyek az alkoholtartalmú italokban és a kenyérben jelen lévő ízesítő vegyületek. A törzsolajokat elágazó láncú 2-oxosavak dekarboxilezésével állítják elő, aromás aminosavakból származnak. A termékeket ezután alkohol-dehidrogenáz (ADH) dehidrogénezi. A PDC aktivitása a 2-oxo savakkal szignifikánsan alacsonyabb, mint a piruvát esetében (ter Schure et al., 1998). Az új aldehid analógok előállítását később tárgyaljuk ebben a fejezetben.

A PDC-aktivitás indukálható és manipulálható mind a tenyészetbe juttatott levegőztetés mértékével, mind a közegben lévő szénhidrát szubsztrát kiválasztásával. A PDC aktivitásra csak anaerob körülmények között van szükség a glikolitikus fluxus engedélyezéséhez; ezért a levegőztetés csökkenésének PDC indukcióját kell eredményeznie. Sims and co-workers (1991) és Rogers et al. (1997) kimutatták, hogy a C. utilis PDC aktivitás növekedése akkor következik be, amikor az oxigénkoncentráció csökken. Egy ilyen válasz rendkívül előnyös az l-PAC előállítása szempontjából. Mindkét kutatócsoport azonban megállapította, hogy a nemkívánatos melléktermékek előállításáért felelős ADH aktivitása anaerob vagy részben anaerob körülmények között meghaladja a PDC aktivitását. A levegőztetési feltételeknek az élesztő fiziológiájára gyakorolt hatását később tárgyaljuk ebben a fejezetben.

a szénhidrátforrás PDC aktivitásának indukálása az érintett élesztőfajtól és a szállított szénhidrátforrástól függ. A glükóz egy szubsztrát, amely képes glikolitikus enzimek, különösen PDC indukálására. Számos munkavállaló bizonyította, hogy a glükóz hozzáadása a kultúrákhoz a PDC aktivitás szintjének növekedését eredményezi. Maitra és Lobo (1971) megállapította, hogy a glükóz hozzáadása impulzusként a Saccharomyces spp. a tenyészetek a glikolitikus enzimek termelésének növekedését eredményezték, beleértve a PDC-t is, rövid késleltetési időszakot követően. A növekedéshez használt közeg szénhidrátmentes volt, szénforrásként acetátot használtak. Hasonlóképpen, Schmitt és Zimmerman (1982) 18-szoros növekedést mutatott a S. cerevisiae PDC aktivitásában, miután glükózt adtak az etanolon, mint egyedüli szénhidrátforráson termesztett rázólombik tenyészethez. Ezek az eredmények megegyeznek Harrison (1972) és Sims et al. (1991). A Sims és munkatársai szintén bizonyították a PDC aktiválás visszafordítható jellegét. Kimutatták, hogy anaerob körülmények között, glükóz nélkül (a biomassza glükózmentes közegben történő centrifugálásával és reszuszpendálásával) a C. utilis PDC aktivitása 50%-kal csökkent. A PDC aktivitást helyreállítottuk glükóz hozzáadásával a táptalajhoz anaerob körülmények között; ha azonban a tenyészetet a glükózpótlás mellett levegőztetjük, a PDC aktivitása nem változott. Az ilyen enzimaktiválás nem fordul elő minden szénhidrát típusnál. Amikor az élesztőfajokat anaerob módon tenyésztik glikozidokon, amelyek a Kluyver hatást fejtik ki, a PDC aktivitása csökken a glikozidokhoz képest, mint például a glükóz, amely anaerob módon metabolizálható (Sims and Barnett, 1991). Kutatásuk eredményeként azt találták, hogy a PDC aktivitása anaerob körülmények között sebességkorlátozó lehet. Ez a megállapítás megegyezik van Urk et al. (1989).

A PDC egy szubsztrát-piruvát-aktivált enzim (Hubner et al., 1978; Hohmann, 1997), amelyet szintén alloszterikusan gátol a szervetlen foszfát (Boiteux and Hess, 1970). Boiteux és Hess arról számolt be, hogy az S. carlsbergensisből származó tisztított PDC Michaelis-állandója (Km) szervetlen foszfát hiányában 1,3 mm-ről körülbelül 11 mM-re nőtt 100 mm-es foszfát jelenlétében. A gátló hatást versenyképes jellegűnek határoztuk meg, a Km-ben kifejezett változás nem befolyásolta az enzim maximális aktivitását. Meghatároztuk, hogy a PDC érzékenysége a foszfát általi gátlásra ugyanolyan nagyságrendű, mint a piruvát általi aktiválásra való érzékenysége.Saccharomyces spp. a C. utilis-t általában az l-PAC előállításához használják; a korai munka során azonban keveset tettek az enzimaktivitások közvetlen összehasonlítására. A S. cerevisiae és a C. utilis PDC-jeit összehasonlították van Dijken és Scheffers (1986), valamint Van Urk et al. (1989). Megállapították, hogy az S. cerevisiae PDC aktivitása körülbelül nyolcszorosa a C. utilis PDC-jének, bár az előbbi PDC-je érzékenyebbnek bizonyult a foszfát általi gátlásra. A foszfát tekintetében, a C. utilis PDC hasonló Km-értékeket mutatott, mint az S. carlsbergensis, ugyanis 3.Foszfát hiányában 6 mm, 11 mm 100 mm foszfát jelenlétében. Ezzel szemben az S. cerevisiae PDC-je foszfát hiányában 3,0 mm-es, 100 mm-es foszfát jelenlétében pedig 48 mm-es Km-értéket mutatott. Következésképpen a foszfát elérhetősége fontos szerepet játszik a PDC aktivitásában, így a PDC termelékenységében. Van Urk és munkatársai a foszfát citoszolkoncentrációjának csökkentését és a piruvátkoncentráció emelkedését javasolták. (1989), mint hozzájáruló tényezők a megnövekedett PDC aktivitáshoz, miután a tenyészetet glükózzal pulzálták. A folyamat által használt Oliver et al. (1997) az erjedés közepén melasszal pulzált, ezért a PDC aktivitásának hasonló növekedése valószínűleg azt eredményezte volna.

jelentős munkát végeztek Rogers és munkatársai (Chow et al., 1995; Shin and Rogers, 1996a; Rogers et al., 1997) A C. utilis PDC kinetikájának értékelésére mind tisztított formában, mind teljes sejtekben. 0,85–0,9 U/mg fehérje PDC aktivitását regisztrálták a teljes, stacionárius fázisú biomassza esetében a szakaszos tenyészetben történő növekedés után. Részleges tisztítás után Chow et al. (1995) a PDC aktivitás növekedését 4,8 U/mg fehérjére emelte, ami összehasonlítható volt a kereskedelemben kapott PDC-vel. Pohl (1997) azt sugallja, hogy az élesztőből és növényekből tisztított PDC specifikus aktivitása 45-60 e/mg tartományban érhető el.

Rogers et al. (1997) számos kinetikai paramétert jelentett a tisztított PDC számára a C. utilis-től. A Benzaldehidre és a piruvátra vonatkozó Km-értékek sorrendben 42 mm-esek (4 CAC., pH. 7,0), illetve 2,2 mm-esek (25 C., pH. 6,0) voltak, a telítettség biztosításához 10 mm-nél nagyobb piruvát-koncentrációra volt szükség. Az acetaldehid gátlási állandója (Ki) körülbelül 20 mm volt, míg a szubsztrát gátlása nyilvánvaló volt a 180 mm-t meghaladó benzaldehid-koncentrációknál (19,1 g/l).

Chow et al. (1995) tanulmányokat végzett a PDC benzaldehid általi deaktiválásának kinetikájának meghatározására. Megállapították, hogy a deaktiválás a benzaldehid elsőrendű kinetikáját követte; a válasz azonban nem volt lineárisan összefüggésben a 100-300 mm közötti benzaldehid-koncentráció idejével.

az l-PAC előállításával kapcsolatos munka nagy részében a PDC nem bizonyult az l-PAC termelését korlátozó tényezőnek (Vojtisek and Netrval, 1982; Shin and Rogers, 1996a; Tripathi et al., 1997), mivel néhány PDC aktivitás az erjedés végén maradt. Inkább Tripathi és munkatársai (1997), Vojtisek és Netrval (1982) azt találták, hogy az alacsony piruvát koncentráció a közepes korlátozott hozamok. A glikolitikus enzimek potenciálisan sebességkorlátozóként szerepeltek mind Tripathi, mind munkatársai, valamint Nikolova és Ward (1991).

a fenti információk alapján Oliver et al. (1997) (lásd a 4.szakaszt) úgy tűnik, hogy nagymértékben elősegíti az l-PAC gyártását. A piruvát jelentős mennyiségben van jelen, Hohmann (1997) szerint a piruvát-dehidrogenáz kapacitása korlátozott a PDC-hez képest, ezáltal korlátozza a piruvát metabolizmusát az egyetlen alternatív úton. Ezenkívül a biomasszát szénhidráttal egészítik ki csökkentett levegőztetéssel kombinálva. The work of Sims and Barnett (1991) és Sims et al. (1991) azt jelzi, hogy e két feltétel kombinációja elősegíti a PDC indukcióját.