Il ritmo crescente con cui vengono completati i progetti di sequenziamento del genoma ha aumentato la necessità di metodi ad alto rendimento per il controllo dell’espressione genica. Un possibile approccio è l’uso di oligonucleotidi antisenso per legare l’mRNA e prevenire la sintesi proteica. In teoria, questa strategia consente un rapido progresso dalla sintesi degli oligomeri all’osservazione del fenotipo . In pratica, la tecnologia antisenso è stata afflitta da una propensione per interazioni non specifiche, e queste hanno rallentato la sua ampia applicazione alle indagini biologiche . Recentemente, tuttavia, i miglioramenti nelle proprietà chimiche degli oligonucleotidi e nella nostra comprensione del loro meccanismo d’azione si sono combinati per rendere più probabile il loro uso di successo. Il lavoro di un certo numero di laboratori suggerisce ora che gli oligonucleotidi del morfolino possono essere microiniettati in embrioni di zebrafish , ricci di mare o Xenopus , dove bloccano l’espressione genica e producono effetti fenotipici durante le prime fasi dello sviluppo.

Gli oligonucleotidi di Morfolino sono analoghi del DNA non ionico disponibili da Gene Tools LLC . Possiedono collegamenti dorsali alterati rispetto al DNA o all’RNA (Figura (Figure1).1). Nonostante la loro spina dorsale alterata, i morfolini si legano alle sequenze di acidi nucleici complementari mediante l’accoppiamento di base Watson-Crick. Questo legame non è più stretto del legame di analoghi oligomeri di DNA e RNA, che richiede l’uso di morfolini a 25 basi relativamente lunghi per l’inibizione del gene antisenso. La spina dorsale rende i morfolini resistenti alla digestione da parte delle nucleasi. Inoltre, poiché la spina dorsale manca di carica negativa, si pensa che i morfolini abbiano meno probabilità di interagire in modo non selettivo con le proteine cellulari; tali interazioni spesso oscurano l’osservazione dei fenotipi informativi. I punti di forza dei morfolini come strumenti per studiare lo sviluppo dei vertebrati sono ben descritti in una recente recensione di Ekker . Il loro più grande vantaggio è che i fenotipi possono essere osservati rapidamente negli animali F0 utilizzando un metodo relativamente economico.

Strutture di DNA e morfolino oligonucleotidi. R e R ‘indicano la continuazione della catena oligomerica nella direzione 5′ o 3’, rispettivamente.

Uno dei principali ostacoli all’uso di oligonucleotidi antisenso è la scelta di una sequenza target. Gli oligonucleotidi antisenso che contengono DNA sono in grado di formare ibridi RNA-DNA. Questi ibridi possono fungere da substrato per la RNasi H, che promuove la scissione del bersaglio mRNA. Poiché l’RNA è degradato, qualsiasi sequenza all’interno della regione codificante del gene bersaglio ha il potenziale per essere un sito antisenso utile. I morfolini, al contrario, formano ibridi RNA-morfolino che non sono substrati per la RNasi H, e quindi l’mRNA non viene degradato. Questa è una considerazione importante, perché i morfolini mirati alla maggior parte della regione di codifica saranno spostati dal ribosoma mentre traslocano lungo l’mRNA e quindi saranno inefficaci nel prevenire la traduzione. Gli oligonucleotidi di Morfolino mirati alla regione 5 ‘ – non tradotta (UTR) o al codone iniziale potrebbero funzionare preferenzialmente, impedendo che il macchinario di traduzione si leghi, ma non vi è alcuna garanzia che questa sia una regola generale e che dovrà essere dimostrata empiricamente per ciascun gene bersaglio.

Ekker e colleghi riferiscono che oligonucleotidi morfolino marcati fluorescentemente possono essere iniettati in embrioni di zebrafish a stadio sferico e ottenere una distribuzione uniforme. Gli oligomeri di Morfolino mirati al codone iniziale per la proteina fluorescente verde (GFP) hanno bloccato l’espressione di GFP, mentre gli oligomeri di controllo che sono complementari a GFP non lo hanno fatto. Il livello di mRNA GFP non è stato modificato, il che è come previsto se la RNasi H non è coinvolta. Questi esperimenti di modello sono significativi perché stabiliscono la capacità degli oligomeri di morfolino di bloccare in modo inequivocabile l’espressione genica in modo sequenza-specifico. Ekker e colleghi riportano anche l’inibizione di diversi geni endogeni di zebrafish e hanno iniziato a compilare un database che descrive in dettaglio i fenotipi prodotti dagli oligonucleotidi di morfolino .

I percorsi studiati da Ekker e colleghi che utilizzano i morpholinos includono la segnalazione dello sviluppo attraverso il ligando Sonic hedgehog e l’effetto dell’espressione genica del fattore di crescita angiogenico VEGF-A sull’angiogenesi. Nel complesso, il laboratorio Ekker ha osservato fenotipi interessanti in 16 dei 17 geni presi di mira . Hammerschmidt e colleghi hanno studiato i morfolini mirati al gene del recettore della serina/treonina chinasi di tipo I Alk8 / Lost-a-fin. Lin e colleghi hanno riferito che l’inibizione con morfolinos di fez, che codifica una proteina di zinco-dito, può ridurre l’espressione di dlx2, che codifica una proteina contenente omeodominio, nel proencefalo ventrale. Quando sono stati esaminati i livelli di espressione, sono stati raggiunti significativi “knockdown” dell’espressione genica (fino al 90%).

In organismi diversi da zebrafish, Angerer e colleghi hanno utilizzato morfolini progettati per bloccare la traduzione di SpKr1, un fattore di trascrizione bersaglio per la regolazione β-catenina, in embrioni di ricci di mare . Come con il lavoro di Nasevicius et al. , un’ knockdown ‘ dell’espressione di GFP è stato usato come controllo positivo e l’introduzione di 4 µM anti-SpKr1 morpholino ha provocato il fallimento dell’endoderma per differenziarsi. Heasman et al. hanno studiato segnalazione β-catenina in Xenopus . L’iniezione allo stadio a 2 o 4 cellule blocca la formazione dell’asse dorsale, mentre l’iniezione allo stadio a 8 cellule blocca la formazione della testa . Infine, Erickson e colleghi hanno usato l’elettroporazione per fornire morfolini diretti contro FoxD3 agli embrioni di pulcino. FoxD3 è un fattore di trascrizione alato-elica-classe, e l’introduzione di morpholinos altera il progresso delle cellule neurali-cresta, un risultato coerente con la localizzazione di FoxD3 . Questi esperimenti illustrano il potenziale per i morfolini di sezionare finemente la progressione temporale dello sviluppo. Quando si blocca un gene di funzione sconosciuta o quando si osserva un risultato imprevisto, è importante tenere presente, tuttavia, che il nuovo fenotipo non è necessariamente dovuto alla riduzione dell’espressione del gene bersaglio. Questo avvertimento è presente anche per i knockout genetici standard e implica semplicemente che i risultati dovrebbero essere interpretati con cautela.

Questi dati sono provocatori e suggeriscono che, almeno in questi modelli animali, gli oligomeri antisenso morfolino possono diventare strumenti di routine per generare fenotipi mutanti. È essenziale rendersi conto, tuttavia, che la tecnologia antisenso raramente, se mai, duplica le mutazioni complete di “perdita di funzione”. Avvertiamo anche che i reagenti antisenso sono stati ampiamente utilizzati in passato. I controlli sono mancati, i risultati sono spesso marginali e i fenotipi osservati sono spesso dovuti a un’ampia varietà di meccanismi non antisenso inaspettati. Le cause di questi effetti non antisenso includono interazioni indesiderate con le proteine e il legame con sequenze di acidi nucleici non bersaglio . È quindi imperativo che la metodologia sia applicata con attenzione per evitare di ripetere gli errori passati che hanno rallentato il progresso della tecnologia antisenso.

Come con qualsiasi esperimento antisenso, controlli rigorosi per effetti non specifici sono fondamentali per interpretare correttamente i fenotipi. Gli esperimenti con oligonucleotidi morfolino dovrebbero sempre testare almeno una mancata corrispondenza e un oligomero di controllo strapazzate e i risultati di questi test dovrebbero essere riportati. Sono importanti anche i saggi dose-risposta per determinare il margine tra l’induzione di uno specifico fenotipo e l’insorgenza della tossicità. Ad esempio, questo margine può essere inferiore a due volte, sottolineando la necessità di una determinazione della dose attentamente controllata e di una consegna quantitativa precisa. Ove possibile, i livelli sia della proteina bersaglio che di una o più proteine di controllo devono essere valutati in campioni trattati con morfolini sperimentali e di controllo. Inoltre, Ekker suggerisce che i risultati siano confermati attraverso il salvataggio dell’mRNA e / o confrontandoli con fenotipi di mutanti esistenti .

L’alto tasso di successo per l’inibizione dell’espressione genica da parte degli oligonucleotidi morfolino è sorprendente. Il dogma nel campo antisenso è che il targeting del sito di inizio ATG non è una certa ricetta per il successo, e che ben 40 oligonucleotidi possono avere bisogno di essere testati per identificare uno che inibisce in modo efficiente l’espressione genica . Se il targeting del codone di avvio funziona così bene, perché più investigatori non lo fanno piuttosto che ricorrere a schermi elaborati? I morpholinos possono essere più efficaci di altre sostanze chimiche antisenso, ma perché? Quest’ultima domanda dovrà essere affrontata mediante un’indagine sistematica delle loro proprietà e il confronto con altri tipi di oligonucleotide. La spina dorsale morfolino drammaticamente alterata può forse legarsi all’mRNA in modo più efficace o agire come un blocco migliore alla traduzione. In tal caso, i morfolini potrebbero essere agenti superiori per l’inibizione genica rispetto ad altri tipi di oligomeri che potrebbero bloccare la traduzione, come l’acido nucleico bloccato (LNA), l’acido nucleico peptidico (PNA) o l’RNA modificato 2′. D’altra parte, altri tipi di oligomeri potrebbero funzionare così come, o meglio di, morpholinos, ma il loro potenziale può essere meno evidente perché non sono stati testati in sistemi sperimentali favorevoli.

Osservazioni fuorvianti derivanti da interazioni non specifiche hanno confuso molte ricerche precedenti utilizzando oligonucleotidi . Queste difficoltà hanno portato molti ricercatori ad essere scettici sull’uso degli oligonucleotidi come strumento per la ricerca di base. Il lavoro pubblicato negli ultimi 18 mesi suggerisce, tuttavia, che gli oligomeri del morfolino possono avere proprietà che consentono ai ricercatori di generare regolarmente fenotipi istruttivi. I risultati sono eccitanti, con l’implicazione che gli oligomeri morfolino potrebbero fornire uno strumento generalmente applicabile per la genetica chimica e la genomica funzionale. Per realizzare questo potenziale, è necessario determinare le proprietà che governano l’efficacia di questi reagenti. Queste informazioni consentiranno ai ricercatori di ottimizzare la metodologia e ottenere il massimo “knockdown” di un determinato obiettivo riducendo al minimo gli effetti confondenti e non specifici. Gli utenti di oligomeri morfolino devono capire i problemi che hanno afflitto il campo antisenso in passato, imparare da queste battute d’arresto, ed eseguire esperimenti di controllo appropriati. Questi esperimenti di controllo, almeno quanto la produzione di fenotipi interessanti, determineranno se gli oligonucleotidi morfolino sono la svolta che la recente ricerca suggerisce.