ゲノムシーケンスプロジェクトが完了するペースが高まっているため、遺伝子発現を制御するためのハイスループットメソッドの必要性が高まっている。 一つの可能なアプローチは、mRNAを結合し、タンパク質合成を防止するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用である。 理論的には、この戦略は、オリゴマーの合成から表現型の観察への急速な進歩を可能にする。 実際には、アンチセンス技術は非特異的相互作用の傾向に悩まされており、これらは生物学的研究への幅広い応用を遅らせている。 しかし、最近では、オリゴヌクレオチドの化学的性質の改善とそれらの作用機序の理解が組み合わされて、それらの成功した使用がより可能性が高 いくつかの実験室からの仕事は今morpholinoのオリゴヌクレオチドがzebrafish、ウニまたはアフリカツメガエルの胚にmicroinjectedできることを提案し、遺伝子発現を妨げ、開発の初期段階の間に表現型の効果を作り出す。モルホリノオリゴヌクレオチドは、Gene Tools LLCから入手可能な非イオン性DNA類似体である。

それらは、DNAまたはRNAと比較して変化した骨格結合を有する（図（図1））。1). それらの改変された骨格にもかかわらず、モルフォリノはWatson-Crick塩基対形成によって相補的な核酸配列に結合する。 この結合はアンチセンスの遺伝子の阻止のための比較的長い25基盤のmorpholinosの使用を必要とする類似したDNAおよびRNAのオリゴマーの結合より堅くない。 骨格は、ヌクレアーゼによる消化に対してモルフォリノを耐性にする。 また、バックボーンは負の電荷を欠いているため、モルフォリンは細胞タンパク質と非選択的に相互作用する可能性が低いと考えられている。 脊椎動物の発達を調査するためのツールとしてのモルフォリノの強みは、Ekkerによる最近のレビューによく記載されています。 それらの最大の利点は、表現型が比較的安価な方法を用いてＦ０動物において迅速に観察され得ることである。p>

DNAとモルホリノオリゴヌクレオチドの構造。 ＲおよびＲ’は、それぞれ５’方向または３’方向のオリゴマー鎖の継続を示す。

アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に対する大きな障害は、標的配列を選択することである。 DNAを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、RNA-DNAハイブリッドを形成することができる。 これらの雑種は、ｍＲＮＡ標的の切断を促進するＲｎａｓｅ Ｈの基質として作用することができる。 ＲＮＡは分解されるので、標的遺伝子のコード領域内の任意の配列は、有用なアンチセンス部位である可能性を有する。 対照的に、モルフォリノは、RNase Hの基質ではないRNA-モルフォリノハイブリッドを形成し、したがってmRNAは分解されない。 コード領域の大部分を標的としたモルフォリノは、mRNAに沿って移動するときにリボソームによって変位され、したがって翻訳を防止するのに効果がないため、これは重要な考慮事項である。 5′-非翻訳領域（UTR）または開始コドンを標的とするモルホリノオリゴヌクレオチドは、翻訳機械が結合するのを防ぐことによって優先的に働くかもしれないが、これが一般的な規則であるという保証はなく、各標的遺伝子について経験的に実証する必要がある。

Ekkerたちは、蛍光標識されたモルホリノオリゴヌクレオチドを球期のゼブラフィッシュ胚に注入し、均一な分布を達成できることを報告している。 緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の開始コドンを標的としたモルホリノオリゴマーはＧＦＰ発現をブロックしたが，ｇｆｐに相補的な対照オリゴマーはブロックしなかった。 ＧＦＰ ｍ ＲＮＡのレベルは変化しなかったが、これは、Ｒｎａｓｅ Ｈが関与していない場合に予想される通りである。 彼らは明確に配列特異的な方法で遺伝子発現をブロックするモルホリノオリゴマーの能力を確立するため、これらのモデル実験は重要です。 Ekkerたちはまた、いくつかの内因性ゼブラフィッシュ遺伝子の阻害を報告し、モルホリノオリゴヌクレオチドによって産生される表現型を詳述したデータベースの作成を開始した。

ekkerらがモルフォリノを用いて調べた経路には、Sonic hedgehogリガンドを介した発生シグナル伝達と、vegf-a血管新生成長因子遺伝子発現が血管新生に及ぼす影響が含まれる。 全体的に、Ekker研究室では、標的とされた16の遺伝子のうち17の興味深い表現型を観察しました。 Hammerschmidtたちは、I型セリン/スレオニンキナーゼ受容体遺伝子Alk8/Lost-a-finを標的としたモルフォリノを調べた。 Linらは、亜鉛指タンパク質をコードするfezのモルフォリノによる阻害が、腹側前脳におけるホメオドメイン含有タンパク質をコードするdlx2の発現を減 発現レベルを調べたところ、遺伝子発現の有意な”ノックダウン”（最大90％）が達成された。

ゼブラフィッシュ以外の生物では、Angererらは、ウニ胚におけるβ-カテニン調節の転写因子標的であるSpkr1の翻訳をブロックするように設計されたモルフォリノを使用している。 Nasevicius et alの作品と同様に。 、ＧＦＰ発現の「ノックダウン」を陽性対照として使用し、４μ Ｍの抗Ｓｐｋｒ１モルホリノの導入は、内胚葉の分化の失敗をもたらした。 Heasman et al. アフリカツメガエルにおけるβ-カテニンシグナリングを研究している。 2細胞または4細胞段階での注入は背軸形成をブロックし、8細胞段階での注入は頭部形成をブロックする。 最後に、Ericksonたちは、電気穿孔法を用いて、foxd3に対するモルフォリノをニワトリ胚に送達した。 Foxd3は翼ヘリックスクラスの転写因子であり、morpholinosの導入は、神経堤細胞の進行を変化させ、Foxd3の局在と一致する結果である。 これらの実験は、モルフォリノが発達の時間的進行を細かく解剖する可能性を示している。 しかし、未知の機能の遺伝子をブロックしたり、予期しない結果を観察したりする場合、新しい表現型は必ずしも標的遺伝子の発現の低下によるものではないことに留意することが重要である。 この警告は、標準的な遺伝子ノックアウトのためにも存在し、単に結果が慎重に解釈されるべきであることを意味します。

これらのデータは挑発的であり、少なくともこれらの動物モデルでは、モルホリノアンチセンスオリゴマーは、変異表現型を生成するためのルーチンのツールになる可能性があることを示唆している。 しかし、アンチセンス技術は、完全な”機能喪失”変異を複製することはめったにないことを認識することが不可欠です。 また、アンチセンス試薬は、過去に広く誤用されていることに注意してください。 対照は欠けており、結果はしばしば限界的であり、観察された表現型は、多くの場合、予期しない非アンチセンス機構の多種多様に起因することが見出されている。 これらの非アンチセンス効果の原因には、タンパク質との意図しない相互作用および非標的核酸配列への結合が含まれる。 したがって、アンチセンス技術の進歩を遅らせてきた過去の間違いを繰り返さないように、この方法論を慎重に適用することが不可欠です。

任意のアンチセンス実験と同様に、非特異的な効果のための厳格なコントロールは、表現型を適切に解釈するために重要です。 モルホリノオリゴヌクレオチドを用いた実験は，少なくとも一つのミスマッチと一つのスクランブルコントロールオリゴマーを常に試験すべきであり，これらの試験の結果を報告すべきである。 特定の表現型の誘導と毒性の発症との間のマージンを決定するための用量応答アッセイも重要である。 例えば、このマージンは、慎重に制御された用量決定および正確に定量化された送達の必要性を強調して、二重未満であり得る。 可能な限り、標的タンパク質と1つ以上の対照タンパク質の両方のレベルは、実験的および対照モルフォリンで処理されたサンプルで評価されるべきである。 加えて、Ｅｋｋｅｒは、結果がｍＲＮＡ救助を介して、および／または既存の変異体の表現型と比較することによって確認されることを示唆している。

モルホリノオリゴヌクレオチドによる遺伝子発現の阻害のための高い成功率は驚くべきことです。 アンチセンス分野の教義は、ATG開始部位を標的とすることは成功のための特定のレシピではなく、40個ものオリゴヌクレオチドを効率的に遺伝子発現を阻害するものを同定するために試験する必要がある可能性があるということである。 スタートコドンをターゲットにすることがうまくいくのであれば、なぜより多くの研究者が精巧な画面に頼るのではなく、これをしないのですか？ モルフォリノは他のアンチセンス化学よりも効果的かもしれませんが、なぜですか？ 後者の質問は、それらの特性の体系的な調査および他のタイプのオリゴヌクレオチドとの比較によって対処する必要がある。 劇的に変化したモルホリノ骨格は、おそらくmRNAにより効果的に結合するか、翻訳に対するより良いブロックとして作用する可能性がある。 そうであれば、モルフォリンは、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、または２’修飾ＲＮＡのような、翻訳をブロックし得る他のタイプのオリゴマーと比較して、遺伝子阻害のための優れた薬剤である可能性がある。 一方、他のタイプのオリゴマーは、モルフォリノと同様に、またはモルフォリノよりも優れているかもしれないが、良好な実験系で試験されていないため、その可能性はあまり明らかではないかもしれない。

非特異的相互作用に起因する誤解を招く観測は、オリゴヌクレオチドを用いた多くの以前の研究を混乱させている。 これらの困難は、多くの研究者が基礎研究のためのツールとしてのオリゴヌクレオチドの使用に懐疑的であることを導いてきました。 しかし、過去18ヶ月間に発表された研究では、モルホリーノオリゴマーは、研究者が日常的に有益な表現型を生成することを可能にする特性を有する可能性があることが示唆されている。 結果は、モルホリノオリゴマーは、化学遺伝学と機能ゲノミクスのための一般的に適用可能なツールを提供することができるという意味で、刺激的です。 この可能性を実現するためには、これらの試薬の有効性を支配する特性を決定しなければならない。 この情報は、交絡、非特異的な影響を最小限に抑えながら、方法論を最適化し、与えられたターゲットの最大の”ノックダウン”を達成するために研究者を可 モルフォリーノオリゴマーのユーザーは、過去にアンチセンス分野を悩ませてきた問題を理解し、これらの挫折から学び、適切な制御実験を行う必要がありま これらの対照実験は、少なくとも興味深い表現型の生産と同じくらい、モルホリノオリゴヌクレオチドは、最近の研究が示唆している画期的なもので