El ritmo creciente al que se completan los proyectos de secuenciación del genoma ha aumentado la necesidad de métodos de alto rendimiento para controlar la expresión génica. Un enfoque posible es el uso de oligonucleótidos antisentidos para unirse al ARNm y prevenir la síntesis de proteínas. En teoría, esta estrategia permite un rápido progreso de la síntesis de oligómeros a la observación del fenotipo . En la práctica, la tecnología antisentido ha estado plagada de una propensión a interacciones inespecíficas, y éstas han ralentizado su amplia aplicación a las investigaciones biológicas . Recientemente, sin embargo, las mejoras en las propiedades químicas de los oligonucleótidos y en nuestra comprensión de su mecanismo de acción se han combinado para hacer más probable su uso exitoso. El trabajo de varios laboratorios sugiere ahora que los oligonucleótidos de morfolino pueden ser microinyectados en embriones de pez cebra , erizo de mar o Xenopus , donde bloquean la expresión génica y producen efectos fenotípicos durante las primeras etapas de desarrollo.

Los oligonucleótidos de morfolino son análogos de ADN no iónicos disponibles en Gene Tools LLC . Poseen enlaces troncales alterados en comparación con el ADN o el ARN (Figura (Figura 1)).1). A pesar de su espina dorsal alterada, los morfolinos se unen a secuencias de ácido nucleico complementarias por emparejamiento de bases Watson-Crick. Esta unión no es más estrecha que la unión de oligómeros análogos de ADN y ARN, lo que requiere el uso de morfolinos de 25 bases relativamente largos para la inhibición de genes antisentidos. La columna vertebral hace que los morfolinos sean resistentes a la digestión por nucleasas. Además, debido a que la columna vertebral carece de carga negativa, se cree que los morfolinos son menos propensos a interactuar no selectivamente con proteínas celulares; tales interacciones a menudo oscurecen la observación de fenotipos informativos. Las fortalezas de los morfolinos como herramientas para investigar el desarrollo de vertebrados están bien descritas en una revisión reciente de Ekker . Su mayor ventaja es que los fenotipos se pueden observar rápidamente en animales F0 utilizando un método relativamente barato.

Estructuras de ADN y los oligonucleótidos morfolino. R y R’ denotan la continuación de la cadena de oligómeros en la dirección 5′ o 3′, respectivamente.

Un obstáculo importante para el uso de oligonucleótidos antisentidos es elegir una secuencia objetivo. Los oligonucleótidos antisentidos que contienen ADN son capaces de formar híbridos ARN-ADN. Estos híbridos pueden actuar como sustrato de la RNasa H, que promueve la escisión del ARNm diana. Debido a que el ARN se degrada, cualquier secuencia dentro de la región codificante del gen diana tiene el potencial de ser un sitio antisentido útil. Los morfolinos, por el contrario, forman híbridos ARN-morfolino que no son sustratos de la RNasa H, y por lo tanto el ARNm no se degrada. Esta es una consideración importante, porque los morfolinos dirigidos a la mayor parte de la región codificante serán desplazados por el ribosoma a medida que se traslocan a lo largo del ARNm, y por lo tanto serán ineficaces para prevenir la traducción. Los oligonucleótidos de morfolino dirigidos a la región 5’no traducida (UTR) o al codón de inicio podrían funcionar preferentemente, al evitar que la maquinaria de traducción se una, pero no hay garantía de que esta sea una regla general y tendrá que demostrarse empíricamente para cada gen objetivo.

Ekker y sus colegas informan que los oligonucleótidos morfolinos marcados fluorescentemente se pueden inyectar en embriones de pez cebra en estadio esférico y lograr una distribución uniforme. Los oligómeros de morfolino dirigidos al codón de inicio para la proteína fluorescente verde (GFP) bloquearon la expresión de GFP, mientras que los oligómeros de control que son complementarios a GFP no lo hicieron. El nivel de ARNm de GFP no se modificó, lo que es lo esperado si la RNasa H no está involucrada. Estos experimentos de modelos son significativos porque establecen la capacidad de los oligómeros de morfolino para bloquear sin ambigüedades la expresión génica de una manera secuencial específica. Ekker y sus colegas también reportan inhibición de varios genes endógenos de pez cebra y han comenzado a compilar una base de datos que detalla los fenotipos producidos por los oligonucleótidos morfolinos .

Las vías investigadas por Ekker y sus colegas que usan morfolinos incluyen la señalización del desarrollo a través del ligando sónico de erizo y el efecto de la expresión génica del factor de crecimiento angiogénico VEGF-A en la angiogénesis. En general, el laboratorio Ekker ha observado fenotipos interesantes en 16 de los 17 genes seleccionados . Hammerschmidt y sus colegas han investigado morfolinos dirigidos al gen receptor de serina/treonina quinasa tipo I Alk8 / aleta Perdida. Lin y sus compañeros de trabajo han informado que la inhibición con morfolinos de fez, que codifica una proteína de dedo de zinc, puede reducir la expresión de dlx2, que codifica una proteína que contiene homeodominio, en el cerebro anterior ventral. Cuando se examinaron los niveles de expresión, se lograron «caídas» significativas de la expresión génica (hasta el 90%).

En organismos distintos del pez cebra, Angerer y sus colegas han utilizado morfolinos diseñados para bloquear la traducción de SpKr1, un factor de transcripción diana para la regulación de β-catenina, en embriones de erizos de mar . Al igual que con el trabajo de Nasevicius et al. , se utilizó un «derribo» de la expresión de GFP como control positivo, y la introducción de morfolino anti-SpKr1 de 4 µM resultó en que el endodermo no se diferenciara. Heasman et al. han estudiado la señalización de β-catenina en Xenopus . La inyección en la etapa de 2 o 4 células bloquea la formación del eje dorsal, mientras que la inyección en la etapa de 8 células bloquea la formación de la cabeza . Finalmente, Erickson y sus colegas han utilizado la electroporación para administrar morfolinos dirigidos contra FoxD3 a embriones de pollitos. FoxD3 es un factor de transcripción de clase hélice alada, y la introducción de morfolinos altera el progreso de las células de la cresta neural, un resultado consistente con la localización de FoxD3 . Estos experimentos ilustran el potencial de los morfolinos para diseccionar finamente la progresión temporal del desarrollo. Al bloquear un gen de función desconocida o al observar un resultado inesperado, es importante tener en cuenta, sin embargo, que el nuevo fenotipo no se debe necesariamente a la reducción de la expresión del gen objetivo. Esta advertencia también está presente para los knockouts genéticos estándar, y simplemente implica que los resultados deben interpretarse con cautela.

Estos datos son provocativos y sugieren que, al menos en estos modelos animales, los oligómeros antisentidos de morfolino pueden convertirse en herramientas rutinarias para generar fenotipos mutantes. Sin embargo, es esencial darse cuenta de que la tecnología antisentido rara vez, si es que alguna vez, duplica mutaciones completas de «pérdida de función». También advertimos que los reactivos antisentido han sido ampliamente utilizados en el pasado. Los controles han sido escasos, los resultados a menudo son marginales, y los fenotipos observados a menudo se han encontrado que se deben a una amplia variedad de mecanismos inesperados sin sentido. Las causas de estos efectos sin sentido incluyen interacciones no deseadas con proteínas y unión a secuencias de ácido nucleico no objetivo . Por lo tanto, es imperativo que la metodología se aplique cuidadosamente para evitar repetir los errores del pasado que han ralentizado el progreso de la tecnología antisentido.

Al igual que con cualquier experimento antisentido, los controles rigurosos para efectos inespecíficos son críticos para interpretar los fenotipos correctamente. Los experimentos con oligonucleótidos de morfolino siempre deben probar al menos un oligómero de control desajustado y un oligómero de control revuelto, y se deben informar los resultados de estas pruebas. También son importantes los ensayos dosis-respuesta para determinar el margen entre la inducción de un fenotipo específico y el inicio de la toxicidad. Por ejemplo, este margen puede ser inferior al doble, lo que enfatiza la necesidad de una determinación de dosis cuidadosamente controlada y una entrega cuantificada con precisión. Siempre que sea posible, se evaluarán los niveles de la proteína diana y de una o más proteínas de control en muestras tratadas con morfolinos experimentales y de control. Además, Ekker sugiere que los resultados se confirmen a través del rescate de ARNm y / o por comparación con fenotipos de mutantes existentes .

La alta tasa de éxito para la inhibición de la expresión génica por los oligonucleótidos de morfolino es sorprendente. El dogma en el campo antisentido es que apuntar al sitio de inicio de ATG no es una receta segura para el éxito, y que hasta 40 oligonucleótidos pueden necesitar ser probados para identificar uno que inhiba eficientemente la expresión génica . Si apuntar al codón de inicio funciona tan bien, ¿por qué más investigadores no lo hacen en lugar de recurrir a pantallas elaboradas? Los morfolinos pueden ser más efectivos que otras sustancias químicas antisentido, pero ¿por qué? Esta última cuestión deberá abordarse mediante la investigación sistemática de sus propiedades y la comparación con otros tipos de oligonucleótidos. La espina dorsal de morfolino dramáticamente alterada puede tal vez unirse al ARNm de manera más efectiva o actuar como un mejor bloqueo de la traducción. Si es así, los morfolinos podrían ser agentes superiores para la inhibición de genes en relación con otros tipos de oligómeros que podrían bloquear la traducción, como el ácido nucleico bloqueado (LNA), el ácido nucleico peptídico (PNA) o el ARN 2’modificado . Por otro lado, otros tipos de oligómeros podrían funcionar tan bien o mejor que los morfolinos, pero su potencial puede ser menos evidente porque no se han probado en sistemas experimentales favorables.

Las observaciones engañosas resultantes de interacciones inespecíficas han confundido muchas investigaciones previas que utilizan oligonucleótidos . Estas dificultades han llevado a muchos investigadores a ser escépticos sobre el uso de oligonucleótidos como herramienta para la investigación básica. Sin embargo, el trabajo publicado durante los últimos 18 meses sugiere que los oligómeros de morfolino pueden tener propiedades que permiten a los investigadores generar fenotipos instructivos de forma rutinaria. Los resultados son emocionantes, con la implicación de que los oligómeros de morfolino podrían proporcionar una herramienta de aplicación general para la genética química y la genómica funcional. Para realizar este potencial, se deben determinar las propiedades que rigen la eficacia de estos reactivos. Esta información permitirá a los investigadores optimizar la metodología y lograr el máximo ‘derribo’ de un objetivo dado, al tiempo que minimiza los efectos confusos e inespecíficos. Los usuarios de oligómeros de morfolino deben comprender los problemas que han plagado el campo antisentido en el pasado, aprender de estos contratiempos y realizar experimentos de control apropiados. Estos experimentos de control, al menos tanto como la producción de fenotipos interesantes, determinarán si los oligonucleótidos de morfolino son el avance que sugieren investigaciones recientes.