den eskalerande takt vid vilken genomsekvenseringsprojekt slutförs har ökat behovet av hög genomströmningsmetoder för att kontrollera genuttryck. Ett möjligt tillvägagångssätt är användningen av antisensoligonukleotider för att binda mRNA och förhindra proteinsyntes. I teorin möjliggör denna strategi snabba framsteg från syntes av oligomerer till observation av fenotyp . I praktiken har antisense-tekniken plågats av en benägenhet för icke-specifika interaktioner, och dessa har bromsat sin breda tillämpning på biologiska undersökningar . Nyligen har dock förbättringar i oligonukleotidernas kemiska egenskaper och i vår förståelse av deras verkningsmekanism kombinerat för att göra deras framgångsrika användning mer sannolikt. Arbete från ett antal laboratorier tyder nu på att morfolino oligonukleotider kan mikroinjiceras i zebrafisk , sjöborre eller Xenopus embryon , där de blockerar genuttryck och producerar fenotypiska effekter under de tidiga utvecklingsstadierna.

Morfolino oligonukleotider är nonjoniska DNA-analoger tillgängliga från Gene Tools LLC . De har förändrade ryggradsbindningar jämfört med DNA eller RNA (figur (Figure1).1). Trots deras förändrade ryggrad binder morfolinos till komplementära nukleinsyrasekvenser genom Watson-Crick-basparning. Denna bindning är inte hårdare än bindning av analoga DNA-och RNA-oligomerer, vilket kräver användning av relativt långa 25-basmorfolinos för antisensgenhämning. Ryggraden gör morpholinos resistenta mot digestion av nukleaser. Eftersom ryggraden saknar negativ laddning anses det också att morfolinos är mindre benägna att interagera icke-selektivt med cellulära proteiner; sådana interaktioner döljer ofta observationen av informativa fenotyper. Styrkorna hos morpholinos som verktyg för att undersöka ryggradsutveckling beskrivs väl i en ny granskning av Ekker . Deras största fördel är att fenotyper snabbt kan observeras hos F0-djur med en relativt billig metod.

strukturer av DNA och morfolino oligonukleotider. R och R’ betecknar fortsättning av oligomerkedjan i respektive 5′ eller 3′ riktning.

ett stort hinder för användningen av antisensoligonukleotider är att välja en målsekvens. Antisensoligonukleotider som innehåller DNA kan bilda RNA-DNA-hybrider. Dessa hybrider kan fungera som ett substrat för RNAs H, vilket främjar klyvning av mRNA-målet. Eftersom RNA bryts ned har vilken sekvens som helst inom den kodande regionen för målgenen potential att vara ett användbart antisensställe. Morpholinos bildar däremot RNA-morpholino-hybrider som inte är substrat för RNAs H, och därmed bryts mRNA inte ned. Detta är ett viktigt övervägande, eftersom morpholinos riktade till det mesta av kodningsområdet kommer att förskjutas av ribosomen när den translokerar längs mRNA och därför kommer att vara ineffektiv för att förhindra översättning. Morfolino oligonukleotider riktade till 5′-otranslated region (UTR) eller startkodon kan fungera företrädesvis genom att förhindra att översättningsmaskineriet binds, men det finns ingen garanti för att detta är en allmän regel och det måste demonstreras empiriskt för varje målgen.

Ekker och kollegor rapporterar att fluorescerande märkta morfolino-oligonukleotider kan injiceras i zebrafiskembryon i sfärstadiet och uppnå enhetlig fördelning. Morfolino oligomerer riktade mot startkodonet för grönt fluorescerande protein (GFP) blockerade GFP-uttryck, medan kontrolloligomerer som är komplementära till GFP inte gjorde det. Nivån av GFP mRNA ändrades inte, vilket är som förväntat om RNase H inte är inblandad. Dessa modellexperiment är signifikanta eftersom de fastställer morfolino-oligomerernas förmåga att entydigt blockera genuttryck på ett sekvensspecifikt sätt. Ekker och kollegor rapporterar också hämning av flera endogena zebrafiskgener och har börjat sammanställa en databas som beskriver fenotyperna som produceras av morfolino oligonukleotider .

vägar som undersökts av Ekker och kollegor som använder morpholinos inkluderar utvecklingssignalering genom Sonic hedgehog ligand och effekten av VEGF-A angiogenic growth factor genuttryck på angiogenes. Sammantaget har Ekker-laboratoriet observerat intressanta fenotyper hos 16 av de 17 riktade generna . Hammerschmidt och kollegor har undersökt morpholinos riktade mot typ i serin/treoninkinasreceptorgen Alk8 / Lost-A-fin. Lin och medarbetare har rapporterat att hämning med morpholinos av fez, som kodar för ett zinkfingerprotein, kan minska uttrycket av dlx2, som kodar för ett hemodomaininnehållande protein, i ventral framhjärnan. Där uttrycksnivåer undersöktes uppnåddes signifikanta’ knockdowns ’ av genuttryck (upp till 90%).

i andra organismer än zebrafisk har Angerer och kollegor använt morpholinos som är utformade för att blockera översättningen av SpKr1, ett transkriptionsfaktormål för reglering av macai-catenin, i havsborreembryon . Som med arbetet av Nasevicius et al. , en’ knockdown ’ av GFP-uttryck användes som en positiv kontroll, och införandet av 4 occurm anti-SpKr1 morpholino resulterade i misslyckande av endoderm att differentiera. Heasman et al. har studerat signalering av kaukasisk-catenin i Xenopus . Injektion vid 2-eller 4-cellsteget blockerar dorsal-axelbildning, medan injektion vid 8-cellsteget blockerar huvudbildning . Slutligen har Erickson och kollegor använt elektroporation för att leverera morpholinos riktade mot FoxD3 till kycklingembryon. FoxD3 är en winged-helix-klass transkriptionsfaktor, och introduktion av morpholinos förändrar utvecklingen av neurala vapenceller, ett resultat som överensstämmer med lokaliseringen av FoxD3 . Dessa experiment illustrerar potentialen för morpholinos att findissekera den tidsmässiga utvecklingen av utvecklingen. När man blockerar en gen med okänd funktion eller när man observerar ett oväntat resultat är det dock viktigt att komma ihåg att den nya fenotypen inte nödvändigtvis beror på minskning av uttryck av målgenen. Denna varning är också närvarande för vanliga genetiska knockouts, och innebär helt enkelt att resultaten ska tolkas försiktigt.

dessa data är provocerande och föreslår att, åtminstone i dessa djurmodeller, morfolino antisensoligomerer kan bli rutinverktyg för att generera mutanta fenotyper. Det är dock viktigt att inse att antisense-teknik sällan, om någonsin, duplicerar fullständiga’ förlust av funktion ’ mutationer. Vi varnar också för att antisensreagens har missbrukats i stor utsträckning tidigare. Kontroller har saknats, resultaten är ofta marginella och observerade fenotyper har ofta visat sig bero på en mängd olika oväntade icke-antisensmekanismer. Orsakerna till dessa icke-antisenseffekter inkluderar oavsiktliga interaktioner med proteiner och bindning till icke-målnukleinsyrasekvenser . Det är därför absolut nödvändigt att metoden tillämpas noggrant för att undvika att upprepa de tidigare misstag som har bromsat utvecklingen av antisense-teknik.

som med alla antisensexperiment är rigorösa kontroller för icke-specifika effekter kritiska för att tolka fenotyper korrekt. Experiment med morfolino-oligonukleotider bör alltid testa minst en missanpassning och en krypterad kontrolloligomer, och resultaten av dessa tester bör rapporteras. Dos-responsanalyser för att bestämma marginalen mellan induktionen av en specifik fenotyp och uppkomsten av toxicitet är också viktiga. Till exempel kan denna marginal vara mindre än tvåfaldig, vilket betonar behovet av noggrant kontrollerad dosbestämning och exakt kvantifierad leverans. När det är möjligt bör nivåerna av både målproteinet och ett eller flera kontrollproteiner utvärderas i prover behandlade med experimentella och kontrollmorfolinos. Dessutom föreslår Ekker att resultaten bekräftas genom mRNA-räddning och / eller genom jämförelse med fenotyper av befintliga mutanter .

den höga framgångsgraden för hämning av genuttryck av morfolino oligonukleotider är överraskande. Dogmen i antisensfältet är att inriktning på ATG – startplatsen inte är ett visst recept på framgång, och att så många som 40 oligonukleotider kan behöva testas för att identifiera en som effektivt hämmar genuttryck . Om inriktning på startkodon fungerar så bra, varför gör fler utredare inte detta snarare än att tillgripa utarbetade skärmar? Morpholinos kan vara effektivare än andra antisenskemier, men varför? Den senare frågan måste behandlas genom systematisk undersökning av deras egenskaper och jämförelse med andra typer av oligonukleotid. Den dramatiskt förändrade morpholino-ryggraden kan kanske binda till mRNA mer effektivt eller fungera som ett bättre block för översättning. Om så är fallet kan morfolinos vara överlägsna medel för genhämning i förhållande till andra typer av oligomer som kan blockera översättning, såsom låst nukleinsyra (LNA), peptidnukleinsyra (PNA) eller 2′-modifierat RNA . Å andra sidan kan andra typer av oligomer fungera lika bra som eller bättre än morpholinos, men deras potential kan vara mindre uppenbar eftersom de inte har testats i gynnsamma experimentella system.

vilseledande observationer som härrör från icke-specifika interaktioner har förvirrat mycket tidigare forskning med oligonukleotider . Dessa svårigheter har lett till att många forskare är skeptiska till användningen av oligonukleotider som ett verktyg för grundforskning. Arbete som publicerats under de senaste 18 månaderna tyder dock på att morfolino-oligomerer kan ha egenskaper som gör det möjligt för forskare rutinmässigt att generera lärorika fenotyper. Resultaten är spännande, med implikationen att morfolino oligomerer kan ge ett allmänt tillämpligt verktyg för kemisk genetik och funktionell genomik. För att förverkliga denna potential måste egenskaperna som styr effekten av dessa reagens bestämmas. Denna information gör det möjligt för forskare att optimera metodiken och uppnå maximal ’knockdown’ av ett givet mål samtidigt minimera förvirrande, icke-specifika effekter. Användare av morpholino oligomerer måste förstå de problem som har plågat antisensfältet tidigare, lära av dessa bakslag och utföra lämpliga kontrollexperiment. Dessa kontrollexperiment, åtminstone lika mycket som produktionen av intressanta fenotyper, kommer att avgöra om morfolino oligonukleotider är det genombrott som ny forskning tyder på.