den eskalerende tempo som genom sekvensering prosjekter er fullført har økt behovet for høy gjennomstrømning metoder for å kontrollere genuttrykk. En mulig tilnærming er bruken av antisense oligonukleotider for å binde mRNA og forhindre proteinsyntese. I teorien tillater denne strategien rask fremgang fra syntese av oligomerer til observasjon av fenotype . I praksis har antisensteknologi blitt plaget av en tilbøyelighet til ikke-spesifikke interaksjoner, og disse har bremset sin brede anvendelse på biologiske undersøkelser . Nylig har imidlertid forbedringer i de kjemiske egenskapene til oligonukleotider og i vår forståelse av deres virkningsmekanisme kombinert for å gjøre deres vellykkede bruk mer sannsynlig. Arbeid fra en rekke laboratorier antyder nå at morpholino oligonukleotider kan mikroinjiseres i sebrafisk, sjøkylling eller Xenopus-embryoer, hvor de blokkerer genuttrykk og produserer fenotypiske effekter i de tidlige utviklingsstadiene.Morpholino oligonukleotider Er ikke-ioniske DNA-analoger tilgjengelig Fra Gene Tools LLC . De har endrede ryggradsbindinger sammenlignet MED DNA eller RNA (Figur (Figur1).1). Til tross for deres endrede ryggrad binder morpholinos til komplementære nukleinsyresekvenser ved Watson-Crick base-paring. Denne bindingen er ikke strammere enn binding av analoge DNA-og RNA-oligomerer, noe som nødvendiggjør bruk av relativt lange 25-base morpholinos for antisensgeninhibering. Ryggraden gjør morpholinos resistente mot fordøyelsen av nukleaser. Også fordi ryggraden mangler negativ ladning, antas det at morpholinos er mindre tilbøyelige til å interagere ikke-selektivt med cellulære proteiner; slike interaksjoner skjuler ofte observasjonen av informative fenotyper. Styrken til morpholinos som verktøy for å undersøke vertebratutvikling er godt beskrevet i en nylig gjennomgang av Ekker . Deres største fordel er at fenotyper raskt kan observeres Hos f0-dyr ved hjelp av en relativt billig metode.

et stort hinder for bruken av antisense oligonukleotider er å velge en målsekvens. Antisense oligonukleotider som inneholder DNA er i stand til å danne rna-DNA hybrider. Disse hybrider kan fungere som et substrat For RNase H, som fremmer spaltning av mRNA-målet. FORDI RNA er degradert, har enhver sekvens innenfor den kodende regionen av målgenet potensial til å være et nyttig antisenssted. Morpholinos, derimot, danner rna-morpholino hybrider som ikke er substrater For RNase H, og dermed blir mRNA ikke degradert. Dette er en viktig faktor, fordi morpholinos rettet mot det meste av koding regionen vil bli fortrengt av ribosom som det trans langs mRNA, og derfor vil være ineffektiv i å hindre oversettelse. Morpholino oligonukleotider rettet mot 5 ‘ – untranslated region (UTR) eller startkodonet kan fungere fortrinnsvis ved å forhindre oversettelsesmaskineriet i å binde seg, men det er ingen garanti for at dette er en generell regel, og det må demonstreres empirisk for hvert målgen.Ekker og kolleger rapporterer at fluorescently merkede morpholino oligonukleotider kan injiseres i sfære-scenen sebrafisk embryoer og oppnå jevn fordeling. Morpholino oligomerer rettet mot startkodonet for grønt fluorescerende protein (GFP) blokkerte gfp-uttrykk, mens kontrolloligomerer som er komplementære TIL GFP ikke gjorde det. Nivået PÅ GFP mRNA ble ikke endret, noe som forventes hvis RNase H ikke er involvert. Disse modelleksperimentene er signifikante fordi de etablerer morpholino-oligomers evne til utvetydig å blokkere genuttrykk på en sekvensspesifikk måte. Ekker og kolleger rapporterer også inhibering av flere endogene sebrafiskgener og har begynt å kompilere en database som beskriver fenotypene produsert av morpholino oligonukleotider .Pathways undersøkt Av Ekker og kolleger ved hjelp av morpholinos inkluderer utviklingssignalering gjennom Sonic hedgehog ligand og effekten AV VEGF-en angiogen vekstfaktor genuttrykk på angiogenese. Samlet Sett Har Ekker-laboratoriet observert interessante fenotyper i 16 av de 17 genene som er målrettet . Hammerschmidt og kolleger har undersøkt morpholinos rettet mot type i serin / treoninkinasereceptor Genet Alk8 / Lost-a-fin. Lin og kollegaer har rapportert at inhibering med morpholinos av fez, som koder for et sinkfingerprotein, kan redusere ekspresjonen av dlx2, som koder for et homeodomainholdig protein, i ventral forebrain. Der ekspresjonsnivåer ble undersøkt, ble signifikante ‘knockdowns’ av genuttrykk (opptil 90%) oppnådd .

I andre organismer enn sebrafisk har Angerer og kolleger brukt morpholinos designet for å blokkere oversettelsen Av SpKr1, et mål for transkripsjonsfaktor for β-catenin-regulering, i kråkebolleembryoer . Som med arbeidet Av Nasevicius et al. , en ‘knockdown’ AV GFP uttrykk ble brukt som en positiv kontroll, og innføring av 4 µ anti-SpKr1 morpholino resulterte i svikt i endoderm å differensiere. Heasman et al. har studert β-catenin-signalering i Xenopus . Injeksjon i 2-eller 4-cellers stadium blokkerer dorsal-aksedannelse, mens injeksjon i 8-cellers stadium blokkerer hodedannelse . Endelig Har Erickson og kolleger brukt elektroporasjon for å levere morpholinos rettet mot FoxD3 til kyllingembryoer. FoxD3 er en bevinget helix-klasse transkripsjonsfaktor, og innføring av morpholinos endrer fremdriften av nevrale-crest celler, et resultat i samsvar med lokalisering Av FoxD3 . Disse forsøkene illustrerer potensialet for morpholinos å fin dissekere den tidsmessige utviklingen av utviklingen. Ved blokkering av et gen med ukjent funksjon eller når man observerer et uventet resultat, er det imidlertid viktig å huske på at den nye fenotypen ikke nødvendigvis skyldes reduksjon av ekspresjon av målgenet. Denne advarselen er også til stede for standard genetiske knockouts, og innebærer ganske enkelt at resultatene skal tolkes forsiktig.Disse dataene er provoserende og antyder at morpholino antisense oligomerer, i hvert fall i disse dyremodellene, kan bli rutinemessige verktøy for å generere mutante fenotyper. Det er imidlertid viktig å innse at antisensteknologi sjelden, om noensinne, dupliserer fullstendige mutasjoner. Vi advarer også om at antisensreagenser har blitt mye misbrukt tidligere. Kontroller har manglet, resultatene er ofte marginale, og observerte fenotyper har ofte blitt funnet å skyldes et bredt spekter av uventede ikke-antisense mekanismer. Årsakene til disse ikke-antisense effektene inkluderer utilsiktede interaksjoner med proteiner og binding til ikke-mål nukleinsyresekvenser . Det er derfor viktig at metodikken brukes nøye for å unngå å gjenta de siste feilene som har bremset utviklingen av antisensteknologi.

som med alle antisense eksperiment, strenge kontroller for ikke-spesifikke effekter er avgjørende for å tolke fenotyper riktig. Eksperimenter som bruker morpholino oligonukleotider bør alltid teste minst en mismatch og en kryptert kontroll oligomer, og resultatene av disse testene skal rapporteres. Doseresponsanalyser for å bestemme marginen mellom induksjon av en spesifikk fenotype og begynnelsen av toksisitet er også viktig. For eksempel kan denne marginen være mindre enn todelt, noe som understreker behovet for nøye kontrollert dosebestemmelse og nøyaktig kvantitert levering. Når det er mulig, bør nivåene av både målproteinet og ett eller flere kontrollproteiner evalueres i prøver behandlet med eksperimentelle og kontrollmorfolinos. I Tillegg foreslår Ekker at resultatene bekreftes gjennom mRNA rescue og / eller i forhold til fenotyper av eksisterende mutanter .

den høye suksessraten for inhibering av genuttrykk av morpholino oligonukleotider er overraskende. Dogmet i antisense-feltet er at målretting av ATG start-nettstedet ikke er en viss oppskrift på suksess, og at så mange som 40 oligonukleotider må kanskje testes for å identifisere en som effektivt hemmer genuttrykk . Hvis målretting av startkodonet fungerer så bra, hvorfor gjør ikke flere etterforskere dette i stedet for å ty til forseggjorte skjermer? Morpholinos kan være mer effektive enn andre antisense kjemikalier, men hvorfor? Det sistnevnte spørsmålet må tas opp ved systematisk undersøkelse av deres egenskaper og sammenligning med andre typer oligonukleotid. Den dramatisk endrede morpholino-ryggraden kan kanskje binde seg til mRNA mer effektivt eller fungere som en bedre blokk til oversettelse. I så fall kan morpholinos være overlegne midler for geninhibering i forhold til andre typer oligomer som kan blokkere oversettelse, for eksempel låst nukleinsyre (LNA), peptidnukleinsyre (PNA) eller 2′-modifisert RNA . På den annen side kan andre typer oligomer fungere så vel som, eller bedre enn, morpholinos, men deres potensial kan være mindre tydelig fordi de ikke har blitt testet i gunstige eksperimentelle systemer.Misvisende observasjoner som følge av ikke-spesifikke interaksjoner har forvirret mye tidligere forskning ved bruk av oligonukleotider . Disse vanskelighetene har ført til at mange forskere er skeptiske til bruken av oligonukleotider som et verktøy for grunnforskning. Arbeid publisert i løpet av de siste 18 månedene antyder imidlertid at morpholino oligomerer kan ha egenskaper som tillater forskere rutinemessig å generere lærerike fenotyper. Resultatene er spennende, med implikasjonen at morpholino oligomerer kan gi et generelt anvendelig verktøy for kjemisk genetikk og funksjonell genomikk. For å realisere dette potensialet må egenskapene som styrer effekten av disse reagensene bestemmes. Denne informasjonen vil gjøre det mulig for forskere å optimalisere metodikken og oppnå maksimal knockdown av et gitt mål, samtidig som de minimerer forvirrende, ikke-spesifikke effekter. Brukere av morpholino oligomerer må forstå problemene som har plaget antisensfeltet tidligere, lære av disse tilbakeslagene og utføre passende kontrolleksperimenter. Disse kontrolleksperimentene, minst like mye som produksjonen av interessante fenotyper, vil avgjøre om morpholino oligonukleotider er gjennombruddet som nyere forskning antyder.