Acinetobacter baumannii (a. baumannii) forårsaker sykehuservervede infeksjoner (HAI), som ventilatorassosiert lungebetennelse, bakteriemi, urinveisinfeksjoner, meningitt og kirurgiske sårinfeksjoner, noe som fører til en økende dødelighet hos pasienter. Risikofaktorer for disse infeksjonene inkluderer mekanisk ventilasjon, bruk av bredspektret antibiotika, ICU oppholdstid og koma . Statistisk sett ble omtrent 1.000.000 mennesker globalt smittet med a. baumannii hvert år, og halvparten av disse infeksjonene var forårsaket av multiresistente (MDR) stammer . Dødeligheten av a. baumannii-infeksjon i ICU var 45~60%, til og med 84,3% når pasientene ble infisert med omfattende legemiddelresistens (XDR) A. baumannii . I 2017, Karbapenem-resistent A. baumannii (KRABBE) rangert først når det gjelder trusler mot menneskers helse og haster med å utvikle relevante antibiotika, ifølge den resistente bakterielisten utgitt AV WHO .colistin (CST) Og tegacyklin, de mest brukte antibiotika mot karbapenemaseproduserende GNB, har imidlertid blitt ineffektive på grunn av antibiotikaresistens . For å oppnå klinisk effektivitet måtte leger øke dosen AV CST og kombinere den med tegacyklin . Dessverre, for bakteriemi og alvorlige luftveisinfeksjoner forårsaket av KRABBE og XDR-A. henholdsvis baumannii, kombinasjonsterapi virket fortsatt ikke effektivt . I motsetning til den alvorlige bakterielle motstanden har forskere innsett at det er presserende å utvikle nye antibakterielle strategier i stedet for å stole på tradisjonelle antibiotika.

Generelt er det To måter å designe nye antimikrobielle midler på. Den ene er å hemme produksjonen av essensiell substans for bakterieoverlevelse ; den andre er å hemme virulensfaktorer eller antibiotikaresistensgener av patogene bakterier for å undertrykke patogenitet eller forbedre følsomheten for antibiotika . Imidlertid medfører hemming av enkelt essensiell komponent uunngåelig stort evolusjonært press på bakterier og fremmer utviklingen av høyt nivå stoffresistente stammer . Derfor er den nye intervensjonsstrategien rettet mot ikke-ensensielle prosesser nøkkelen til å overvinne bakteriell motstand . For eksempel blokkerer hemming Av AbaI/AbaR quorum sensing systems med naturlig eller syntetisk inhibitor agent kommunikasjonen mellom bakterier og hemmer biofilmdannelse . Som en klasse av viktige virulensfaktorer i bakterier har ytre membranproteiner (omps) tiltrukket mye mer oppmerksomhet.

OMPs er en klasse av unike integrerte membranproteiner forankret I OM, hvis β – fatstrukturer ble dannet av 8 til 26 tråder. Det er store, forlengede løkker mellom strengene på den ekstracellulære siden og korte løkker på periplasmisk side. Disse egenskapene gir OMPs høy stabilitet i membran og evne til å kjempe mot ekstremt tøffe miljøer . Selv om Forskjellige OMPs har forskjellige sekvenser og funksjoner, deler de lignende struktur og biologiske egenskaper . OMPs av bakterier består av like mange tråder, og viktigere funksjonen og stå skjær nummer avhenger av deres sekvenser. For eksempel, som virulensrelaterte proteiner, har komplementbindende protein OmpX i E. coli og fibronektin-og heparinbindende protein Ail i Yersinia pestis sammenlignbar lignende struktur, men deres sekvensidentitet var lavere enn 45%. Mangfoldet Av omps-sekvens skjer ved N-terminal vesentlig mer Enn C-terminal, og det konserverte β-signalet styrer folding og korrekt montering av OMPs .

imidlertid har typene OMPs I a. baumannii ikke blitt identifisert klart, og bare noen få spredte rapporter var tilgjengelige, hovedsakelig Inkludert BamA, LptD, Omp33–36, OmpW. CarO og OprD. BamA selv som EN omp automatisk kan sette INN I OM og er ansvarlig for montering av andre OMPs ; LptD medierer transport AV LPS til ytre membran (om), tap av som kan forårsake akkumulering av mellomprodukter og feilplassering AV LPS, og til slutt føre til forstyrrelse av bakteriell membranintegritet ; Omp33–36 er en kanal for passasje av vann, som kan indusere apoptose av vertsceller ved å aktivere caspase og regulere autofagi ; OmpW er en slags hydrofob porin som eksisterer I OM og cytoplasma, og spiller en viktig rolle i å modulere homeostase av jernion i bakterier ; CarO og OprD er relatert med resistens av karbapenem .

Blant De OMPs Av A. baumannii, OmpA er den mest dypt studerte virulensfaktoren som spiller nøkkelroller i å regulere adhesjon, aggressivitet og biofilmdannelse Av a. baumannii og immunrespons av verten. Overproduksjon av OmpA er en uavhengig risikofaktor for dødeligheten av nosokomial pneumoni og bakteriemi forårsaket Av a. baumannii . Videre kan uttrykksnivået For ompa målt ved qRT-PCR brukes som en rask diagnostisk indeks for antibiotikaresistent a. baumannii, hvor resultatene er svært konsistente med de gjennom tradisjonell MIC-analyse .denne gjennomgangen overså Strukturen, funksjonen Og patogenesen Til AbOmpA, oppsummerte terapeutiske strategier rettet Mot AbOmpA, og fremhevet hvorfor AbOmpA er et potensielt mål for behandling av a. baumannii.

ompa struktur og funksjon

OmpA ble først identifisert som et varmemodifiserbart protein I Escherichia coli (E. coli) i 1974 og opprinnelig renset i 1977. Dens molekylmasse varierer fra 28 kDa til 36 kDa . Ompa-familien er en gruppe overflateeksponerte porinproteiner med høyt kopieringsnummer I OMPS AV GNB. N-terminaldomenet Til OmpA er en antiparallell β – fatstruktur bestående av åtte transmembranstrenger for å være innebygd i den ytre membranen. De åtte trådene er forbundet med fire lange løkker på overflaten av ytre membran og tre korte svinger i periplasmisk domene som danner kuleformet C-terminal . Selv i en bestemt bakteriestamme er aminosyresekvensene Av OmpA forskjellige blant flere underklasser .

i de senere år, med å klargjøre abompas opprinnelige struktur, har forskere funnet ut At aminosyrene Av AbOmpA fra en rekke kliniske isolater er svært konserverte (> 89%), mens de ikke er homologe for humant proteom . Ved å sammenligne ulike OmpA – lignende proteiner ble de to konservative aminosyrene, R286 Og Asp271, som ligger I C-terminaldomenet Til OmpA, identifisert. Begge aminosyrene binder seg ikke kovalent til diaminopimelataminosyre( DAP), en komponent av peptidoglykan (PGN) . Denne interaksjonen antyder At OmpA spiller en nøkkelrolle for å opprettholde bakteriell overflateintegritet. GENERELT, I GNB arter, ompa stabilisere sin struktur ved selv-dimerization, som hindrer bøyeforbindelser mellom β-fat struktur og periplasmic blir lysert .

AbOmpA er viktig For a. baumannii å holde seg til og invadere epitelceller

a. baumannii er i stand til å komme inn og fortsette inne i vertsceller. For det første holder den seg til vertsceller, invaderer og translokerer til kjernen. Etter å ha drept vertsceller, sprer den seg i blodet og vevet . AbOmpA formidler adhesjon og invasjon Av a. baumannii til epitelceller (Fig. 1a, øvre panel). Sammenlignet med villtype bakterier, er den isogene AbOmpA-mutantstammen vanskeligere å invadere vertsceller. Pre-inkubasjon med rekombinant AbOmpA (rAbOmpA) hemmer dramatisk adhesjon og invasjon av svært invasiv a. baumannii 05KA103 til epitelceller. Og in vivo er patogenesen forsinket av mutasjonen Av AbOmpA, da bevis viste at mindre bakteriell byrde i blod av en murine lungebetennelse modell . For adhesjonsmekanismen Til OmpA, Smani et al. fant at Det var lettere For a. baumannii å feste 96-brønnplater belagt med fibroneksjon enn det som er belagt med BSA, og de identifiserte proteinbindingen med fibroneksjon var OmpA, noe som indikerer at bindingen Av OmpA til firbronektin var det første trinnet i samspillet Mellom a. baumannii med vertsceller.

Funksjoner Av OmpA i a. baumannii. et øvre panel. Ved kontakt med epitelceller, hemmeligheter bakterier ompa i disse cellene. OmpA er i stand til å translokere i kjernen og mitokondrier, og stimulere mitokondrier til å frigjøre cytokrom c. deretter fremmer cytokrom c apoptose inducing factor (AIF) for å translokere til kjernen og til slutt forårsaker apoptose av epitelceller. Nedre panel. OmpA øker produksjonen av nitrogenoksydsyntase (iNOS) og overflateuttrykk av Tolllignende reseptor 2 (TLR2) i epitelceller, som begge utløser vertscelledød. b ved lav konsentrasjon aktiverer OmpA DCs som deretter stimulerer CD4 + T-celler til Å utøve Th1-respons, mens ved høy konsentrasjon; OmpA dreper DCs ved å indusere mitokondrier for å frigjøre ROS. C AbOmpA kan arrestere serum faktor H i serum, forårsaker lammelse av komplementrespons. D AbOmpA spiller en dominerende rolle i å feste abiotiske overflater og danne biofilmmatrise. e AbOmpA er et porinprotein som lokaliserer i ytre membran, selektivt tillater gjennomtrengning av små molekylære forbindelser

AbOmpA kan direkte forårsake vertsceller død hvis levert til vertsceller via ytre membranvesikler (OMVs) . Som vist I Fig. 1a, Etter å ha kommet inn i vertsceller, Kan AbOmpA lokaliseres til mitokondrier, noe som fører til frigjøring av molekyler (som cytokrom C, apoptoseinducerende faktor (AIF)) i tidlig stadium Av a. baumannii-infeksjon, nedbryter aif kromosom DNA og letter apoptose av epitelceller . I tillegg kan OmpA også trans til kjernen av vertsceller avhengig av sin monopartite kjernefysiske lokalisering signal (NLS)- «KTKEGRAMNRR», som ligger mellom rester 320 og 330 Av OmpA. Denne subcellulære målretting av rAbOmpA kan indusere apoptose av vertsceller, men den spesifikke underliggende mekanismen er ikke klar . rAbOmpA renset Fra A. baumannii ATCC19606 ved en konsentrasjon på 6 µ / mL er tilstrekkelig til å utøve cytotoksisitet overfor humane laryngeale epiteliale HEp-2-celler . AbOmpA fremmer a. baumannii å tilhenger til og invadere vertsceller, som fører til deres død ved å lokalisere i mitokondrier og kjerne, men om AbOmpA virker i andre organeller gjenstår å bli utforsket.

AbOmpA stimulerer medfødt immunrespons

AbOmpA påvirker også vertsimmunsystemet. Selv Om AbOmpA-behandling ikke påvirker ekspresjonsnivået av proinflammatoriske cytokiner eller kjemokin, øker det produksjonen av nitrogenoksidsyntase (iNOS) og overflateuttrykk av Tolllignende reseptor 2 (TLR2) I HEp-2-celler (Fig. 1a, nedre panel). Begge er viktige i vertsforsvarsmekanismen. Nitrogenoksid (NO) utøver bakteriostatiske og bakteriedrepende funksjoner ved lungeinfeksjon , og dette oksidative stresset gir en annen årsaksfaktor til celledød. Og TLRs gjenkjenner patogenassosierte molekylære mønstre (PAMPs) og utløser immunrespons . Effektene Av AbOmpA på benmarg-avledede dendrittiske celler (DCs) er illustrert I Fig. 1b. AbOmpA ved en konsentrasjon på 200 ng/mL aktiverer DCs VIA TLR2, MAPK og NF-kB-bane, og stimulerer CD4 + T-celler mot En Th1-respons . AbOmpA har imidlertid en tendens til å drepe Dc-Er ved høye konsentrasjoner (≥3 µ/mL) ved å øke DEN reaktive oksygenarten (ROS) fra mitokondrier . Inokulering med rAbOmpA kan indusere stype 2 immunrespons hos mus, noe som skadet balansen MELLOM IL-4 OG INF-c og førte til forekomst av infeksjon . I Tillegg paralyserte AbOmpA komplementresponssystemet ved å arrestere serumfaktor H (Fig. 1c).

AbOmpA induserer biofilmdannelse

Biofilm gjør At a. baumannii kan overleve under fiendtlige forhold, hovedsakelig bestående av protein, ekstracellulært DNA og polysakkarider. Ifølge statistikken Fra National Institutes Of Health og Center For Disease And Prevention ble 65-80% menneskelige infeksjoner forårsaket av biofilmdannende bakterier . Basert på de multifunksjonelle egenskapene til biofilmdannelse ble det identifisert en rekke gener assosiert med bakteriell adhesjon og biofilmdannelse, som AbOmpA, beta-laktamase PER-1 (blaPER-1) og biofilmassosiert protein (Bap) . Faktisk Spiller Ompa Av A. baumannii ATCC19606 en dominerende rolle i å danne stabil biofilm på plastoverflaten(Fig. 1d). AbOmpA mutantstammer mislykkes i å danne biofilm, mens etterfylling Av AbOmpA allel effektivt gjenoppretter evnen .

Gjennomtrengning av småmolekylære antibiotika Gjennom AbOmpA

Poriner Er bare β-fatproteiner som er funnet i YTRE membran AV GNB. AbOmpA er den mest omfattende porin assosiert med legemiddelresistens, epitelceller vedlegg og biofilm dannelse . Smani et al. først viste Effekten Av AbOmpA på fenotypen av multiresistent a. baumannii, og fant at uttømmingen Av ompa-genet reduserte MICs av kloramfenikol, aztreonam og nalidixic med henholdsvis 8, 8 og 2,67 ganger. Disse dataene antydet At OmpA kan delta i ekstrudering av antibakteriell forbindelse fra periplasmisk region og par med efflux-systemer i indre membran . Transmembrantransporten kontrollert av poriner er en viktig måte for å levere næringsstoffer og liten molekylær hydrofil antibakteriell forbindelse til bakterier . Ramkumar et al. fant At AbOmpA selektivt tillot passasje av små molekylære antibiotika(Fig. 1e). FOR eksempel trenger etx2514, den bredspektrede β-laktamasehemmeren, Gjennom AbOmpA og forsterker den antibakterielle aktiviteten til sulbactam på En AbOmpA-avhengig Måte. I fremtiden vil avklare AbOmpA krystallstruktur avsløre forholdet mellom foreløpig struktur av substrat, porinprotein og permeasjon, noe som gir mer informasjon for utforming av små molekylære substrat .

Regulering Av AbOmpA-uttrykk

BLANT GNB er faktorene som påvirker OmpA-uttrykk for Det meste preget Av Escherichia coli, som næringsstoffer, kulturforhold, bakteriofaginfeksjon og metabolske enzymer . Imidlertid blir De OmpA-regulerende mekanismene Til a. baumannii fortsatt utforsket. SELV OM OmpA I GNB har en lignende todelt struktur, er aminosyresekvenser plassert på ytre overflaten av bakterier forskjellige blant forskjellige slektninger . Foruten å lære av studier Av E. coli, skal vi utforske egenskapene Til OmpA I a. baumannii. I de senere år har Det blitt vist At AbOmpA er et stressrelatert ytre membranprotein, hvor uttrykket påvirkes av bakteriens indre og ytre miljø . Under studiet av effektene av temperatur, tørrhet og næringsmangel på den langsiktige overlevelsen av sensitiv stamme ATCC19606 og kliniske isolater, Bravo Z et al. fant at adhesjon og biofilmdannelsesrelaterte gener, OmpA, bfmR og csuAB, alle var nedregulert i sultet celler, noe som førte til vanskeligheter med å danne biofilmer og spredning Av a. baumannii i blod . Hfq-protein, en vertsbakteriell faktor som først ble oppdaget I e. coi, er uunnværlig FOR rna-syntese Av bakteriofag Qb,, og nå regnes det som en transkripsjonell regulator relatert til stressresponser. Hfq-mangel forsinker cellevekst og forbedrer cellulær følsomhet for miljøstress. Uttrykket nivå Av ompa I Hfq mutant belastning er dramatisk lavere enn i en vill type belastning . I Tillegg er det en årsakssammenheng mellom biofilmdannelse og abompa-uttrykk i a. baumannii under behandling av antibiotika ved sub-minimum inhibitoriske konsentrasjoner (MIC). Yoshinori et al. inkuberte ATCC19606 og kliniske isolater med 1/2 M polymyxin B (PMB) og kolistin (CST) i henholdsvis 24 timer, og fant at det var en positiv korrelasjon mellom mRNA-nivået Av AbOmpA og antall biofilmceller i cst-behandlet atcc19606-stamme. De samme resultatene ble observert i R3 kliniske isolater i nærvær AV PMB . Meropenem ved en konsentrasjon på 64 hryvnias/mL og 128 hryvnias/mL økte abompa-ekspresjonen med henholdsvis 1,81 og 1,63 ganger .Totalt sett er det tre faktorer som hovedsakelig er involvert I reguleringen Av AbOmpA i nyere studier. For det første reduserer ugunstige miljøer som sult, produksjonen Av AbOmpA, noe som gjør Det vanskelig For a. baumannii å danne biofilm og holde seg til vertsceller; For Det Andre, Hfq, En transkripsjonell regulator, hvis uttrykksnivå er nært knyttet Til AbOmpA; Til slutt fremmer noen antibiotika ved sub-MIC abompa-uttrykk og biofilmdannelse. Selv om flere faktorer har vist seg forbundet Med ompa exppresion I a. baumannii, gjenstår de underliggende mekanismene å bli utforsket.

Terapeutiske strategier rettet Mot AbOmpA

Polypeptid

I Dag er det syntetiske lille polypeptidet som spesifikt binder Seg til OmpA, designet for å forhindre A. baumannii i kontakt med vertsceller. AOA-2, et syklisk heksapeptid Som blokkerer AbOmpA uten bakteriedrepende aktivitet, reduserer adhesjonen Av a. baumannii, Pseudomonas aeruginosa og E. coli til overflatene av biotisk og abiotisk, og øker signifikant følsomheten Av a. baumannii til CST ved konsentrasjonen av 125 µ/mL. In vivo forbedret intraperitoneal injeksjon AV AOA-2 (10 mg/kg) i kombinasjon med CST (10 mg/kg) overlevelsesraten hos mus med bakteriemi med 20% . I tillegg er det gradvis oppdaget noen klassiske antimikrobielle peptider (Ampere) som interagerer Med AbOmpA, som er en serie endogene forsvarspeptider for å drepe bakterier og sopp . For eksempel drepte bovint myeloid antimikrobielt peptid (BMAP-28) og dets analoge peptider MDR-a. baumannii ved å interagere Med AbOmpA. Disse forbindelsene begynte a odelegge A. baumannii ved en konsentrasjon på 40 µ / mL innen bare 15 min, og etter 30 min, var bakteriecellene åpenbart skadet med lekkende cytoplasma . I TILLEGG interagerte LL-37 med aminosyrerester 74-84 Av AbOmpA på en doseavhengig måte, noe som reduserte adhesjonen Av A. baumannii til vertsceller. DENNE hemmende effekten AV LL-37 på adhesjon ble imidlertid sterkt redusert etter AbOmpA-sletting . Human defensing – 5 (HD5) er et endogent peptid som dreper MDR – a. baumannii. FOR å øke den antibakterielle aktiviteten TIL HD5 ble ikke-kationiske og ikke-hydrofobe rester erstattet av positivt ladet arginin for å oppnå Et derivat Kalt HD5d5, som sterkt kunne binde Seg Til AbOmpA og deretter utøve sin toksinnøytraliserende funksjon . SELV om DET er holdepunkter FOR AT MDR-Staphylococcus aureus er resistente MOT LL-37 ved å produsere katabolske enzymer, er Det ikke rapportert Om A. baumannii kan utvikle resistens mot naturlige Forsterkere. Det syntetiske lille peptidet, spesielt rettet Mot AbOmpA uten bakteriedrepende aktivitet, kan unngå å utløse bakterielt evolusjonstrykk og kan brukes alene eller kombinert med andre antibakterielle forbindelser for å utøve synergistiske effekter.

Vaksine

Som et ideelt antigen av vaksine er AbOmpA bevart blant ulike kliniske stammer med genomet som er forskjellig fra humant genom . Luo G et al. funnet at immuniserende mus med 3 µ rOmpA i 0,1% aluminiumhydroksid (Al (OH)3) signifikant forbedret overlevelsesraten for diabetiske dyr infisert Av A. baumannii HUMC1 med 40%, og redusert antall bakteriekolonier i alle organer (unntatt lunge) med ti ganger, sammenlignet med kontroll. I tillegg Ble IgG-antistoffet mot rOmpA i serum også dramatisk forbedret . Badmasti F et al. viste at overlevelsesraten for mus med disseminert sepsis indusert AV ATCC19606 var bemerkelsesverdig forbedret (70%) etter behandling Med rekombinant konservert immunodominant region Av AbOmpA (8-346aa), og i tillegg økte kombinasjonen Med Bap(1-487aa) også overlevelsesraten (> 80%) av mus infisert AV MDR AB-44 . Videre ble noen derivater Av AbOmpA med høyere antigenicitet og lavere toksisitet designet av bioinformatiske og immunoinformatiske verktøy. For eksempel ble en ny immunogen modell med 12 tråder oppnådd ved å modifisere aminosyresekvenser Av OmpA, hvor K320 Og K322 ble erstattet Av Alanin, «NADEEFWN» ble erstattet av «YKYDFDGVNRGTRGTSEEGTL», «VVQPGQEAAAPAAAQ» lokalisert Ved C-terminal og posisjon 1-24 Av N-terminal ble fjernet. Dette abompa-avledede antigenet var i stand til å utløse produksjon av antistoffer som dreper Pseudomonas aeruginosa og a. baumannii . EN ANNEN MÅTE er å utvikle DNA-vaksine, som har tiltrukket seg mer oppmerksomhet på grunn av effektiviteten og holdbarheten. DNA-vaksine er betydelig sikker og tolerabel fordi DEN ikke inneholder svekket eller død patogen under produksjonen . Hossein et al. klonet AbOmpA-genet og satt det inn i en eukaryotisk uttrykksvektor pBudCE4. 1 for å oppnå den rekombinante pBudCE4.1–ompA. Etter transfeksjon med dette rekombinante plasmidet uttrykte humane dermale fibroblastceller (HDF) effektivt AbOmpA . Deretter evaluerte de det immunogene potensialet til pBudCE4. 1-ompa i musemodell. ETTER immunisering med denne vaksinen økte IL-2, IL-4, IL-12, IgM, IgG og INF-γ dramatisk i serum og flere dyr overlevde sammenlignet med kontrollgruppen . Vi bør imidlertid ikke ignorere det onkogene potensialet av rekombinante molekyler på grunn av dets tilfeldige integrering i vertsgenom.

Monoklonale antistoffer (mAbs)

det er allment akseptert at antistoffer kan brukes til forsvar mot mikrobielle infeksjoner. Passiv immunisering indusert av antistoffer rettet Mot AbOmpA ble tidligere vurdert som en potensiell terapeutisk metode for MDR-og XDR-a. baumannii-infeksjoner . Imidlertid har behandling med polyklonal anti-OmpA sera vist mange uunngåelige mangler, som immunkompleks overfølsomhet, lavt innhold av spesifikke antistoffer og potensiell fare for smittsomme sykdommer spredt . Nylig bidrar monoklonalt antistoff (mAb) teknologi til utviklingen av antibakterielle mAbs. Sammenlignet med polyklonal anti-OmpA sera, har mAbs flere fordeler, for eksempel høyere sikkerhet, bedre homologi og mer spesifikke mål . MAbs rettet mot OmpA fremmer makrofager for å drepe a. baumannii 307.30 (AB307.30), unntatt de som er dekket med tykk kapsel, spesielt XDR-a. baumannii. Bevis viste at bindingen av mAbs til kliniske isolater var mye svakere enn mellom mABs og ATCC19606. Om kapselen over celleveggen hindrer mAbs fra binding TIL XDR-a. baumannii? Den k1 kapsel-negative mutantstammen (AB307.30) sterkt kombinert med Anti-Ompa mAbs, noe som tyder på at kapselpolysakkarider kan beskytte bindingsstedene Til OmpA . Den dårlige kombinasjonen mellom mAbs og XDR-a. baumannii må løses i det videre, og mAbs kan også brukes til andre konserverte epitoper Av a. baumannii.