2.2 dekarboksylaza Pirogronianowa i dostarczanie substratów

jak opisano powyżej, PDC jest enzymem odpowiedzialnym za produkcję L-PAC. PDC zwykle występuje jako dimery lub tetramery, przy czym aktywny HOLOENZYM PDC ogólnie istnieje jako tetramer, podczas gdy apoenzym istnieje jako dimer (Pohl, 1997). Istnienie form dimeru i tetrameru jest zależne od pH. U drożdży PDC występuje tylko jako tetramer w zakresie pH 5,5-6.5, zarówno jako tetramery, jak i dimery przy wartościach pH do 9,5, A dimery tylko przy pH > 9,5 (Pohl, 1997). Jednak Hohmann (1997) zgłosił istnienie PDC tylko w postaci dimerów przy pH 8,4. PDC od Z. mobilis stwierdzono, że istnieje tylko w postaci tetramerów (Pohl, 1997). Choć wcześniej uważano, że podjednostki PDC mają różne kompozycje, obecnie wiadomo, że są identyczne (Hohmann, 1997).

w Saccharomyces cerevisiae zidentyfikowano łącznie sześć genów PDC, z których trzy są genami strukturalnymi (PDC1, PDC5 i PDC6), a pozostałe trzy uważa się za geny związane z ekspresją PDC (PDC2, PDC3, PDC4) (Flikweert i wsp., 1996; Hohmann, 1997; Pohl, 1997; ter Schure et al., 1998). Pojedynczy gen strukturalny kodujący PDC został zidentyfikowany w Z. mobilis (Pohl, 1997). Podczas gdy większość prac w tej dziedzinie wydaje się być wykonywana na S. cerevisiae, geny dla PDC zostały zidentyfikowane w wielu gatunkach drożdży, nie wliczając Candida utilis. Flikweert i współpracownicy podjęli badania w celu oceny roli każdego z izoenzymów w ogólnej aktywności PDC i stwierdzili, że ekspresja każdego z izoenzymów w S. cerevisiae różni się. Stosując hodowlę wsadową z etanolem lub glukozą jako substratem węgla, PDC1 wyrażano konstytucyjnie, podczas gdy PDC5 indukowano w obecności glukozy. PDC6 był obecny na nieznacznym poziomie. Wyniki te zostały powtórzone w przeglądzie dekarboksylaz pirogronianowych przeprowadzonym przez Hohmanna (1997), który wykazał, że tylko PDC1 i PDC5 odgrywały pozorną rolę w katabolizmie cukru, przy czym 80-90% i 10-20% całkowitej aktywności PDC przypisywano odpowiednio tym dwóm Genom dla biomasy wyhodowanej w glukozie.

oprócz produkcji acetoiny stwierdzono, że PDC S. cerevisiae zajmuje się produkcją olejów fuzelowych, które są związkami smakowymi obecnymi w napojach alkoholowych i chlebie. Oleje fuzelowe powstają w wyniku dekarboksylacji rozgałęzionych kwasów 2-okso, pochodzących z aminokwasów aromatycznych. Produkty są następnie dehydrogenowane przez dehydrogenazę alkoholową (ADH). Aktywność PDC z kwasami 2-okso jest znacznie niższa niż w przypadku pirogronianu (ter Schure i in., 1998). Produkcja nowych analogów aldehydu jest omówiona w dalszej części tego rozdziału.

aktywność PDC może być indukowana i manipulowana zarówno przez stopień napowietrzania dostarczanego do hodowli, jak i przez wybór substratu węglowodanowego w pożywce. Aktywność PDC jest wymagana, aby umożliwić strumień glikolityczny tylko w warunkach beztlenowych; dlatego zmniejszenie napowietrzania powinno skutkować indukcją PDC. Zarówno Sims i współpracowników (1991) i Rogers et al. (1997) wykazały, że wzrost aktywności C. utilis PDC występuje, gdy stężenie tlenu jest zmniejszone. Taka odpowiedź jest bardzo korzystna dla produkcji l-PAC. Jednak obie grupy badaczy odkryły, że aktywność ADH, odpowiedzialnego za wytwarzanie niepożądanych produktów ubocznych, przekracza aktywność PDC w warunkach beztlenowych lub częściowo beztlenowych. Wpływ warunków napowietrzania na fizjologię drożdży omówiono w dalszej części tego rozdziału.

Indukcja aktywności PDC przez źródło węglowodanów zależy od gatunku drożdży i dostarczonego źródła węglowodanów. Glukoza jest jednym substratem zdolnym do indukowania enzymów glikolitycznych, zwłaszcza PDC. Wielu pracowników wykazało, że dodanie glukozy do hodowli powoduje wzrost poziomu aktywności PDC. Maitra i Lobo (1971) odkryli, że dodanie glukozy jako impulsu do Saccharomyces spp. hodowle spowodowały wzrost produkcji enzymów glikolitycznych, w tym PDC, po krótkim okresie opóźnienia. Podłoże używane do wzrostu było wolne od węglowodanów, a jako źródło węgla użyto octanu. Podobnie Schmitt i Zimmerman (1982) wykazali 18-krotne zwiększenie aktywności PDC S. cerevisiae po dodaniu glukozy do hodowli kolby shake hodowanej na etanolu jako jedynym źródle węglowodanów. Wyniki te są zgodne z wynikami Harrisona (1972)i Sims et al. (1991). Simowie i współpracownicy wykazali również odwracalny charakter aktywacji PDC. Wykazali oni, że w warunkach beztlenowych, po pozbawieniu glukozy (poprzez odwirowanie i wymieszanie biomasy w środowisku wolnym od glukozy) aktywność PDC C. utilis została zmniejszona o 50%. Aktywność PDC została przywrócona przez dodanie glukozy do podłoża w warunkach beztlenowych; jednakże, jeśli hodowla była napowietrzana oprócz suplementacji glukozą, nie było zmiany aktywności PDC. Taka aktywacja enzymu nie występuje dla wszystkich typów węglowodanów. Gdy gatunki drożdży są uprawiane beztlenowo na glikozydach, które dają efekt Kluyvera, aktywność PDC jest zmniejszona w porównaniu z glikozydami, takimi jak glukoza, które mogą być metabolizowane beztlenowo (Sims and Barnett, 1991). W wyniku swoich badań odkryli, że aktywność PDC może ograniczać szybkość w warunkach beztlenowych. To stwierdzenie jest zgodne z tym van Urk et al. (1989).

PDC jest enzymem aktywowanym substratem-pirogronianem (Hubner et al., 1978; Hohmann, 1997), który jest również allosterycznie hamowany przez fosforan nieorganiczny (Boiteux i Hess, 1970). Boiteux i Hess odnotowali wzrost stałej Michaelisa (Km) oczyszczonego PDC z S. carlsbergensis z 1,3 mm przy braku fosforanu nieorganicznego do około 11 mM w obecności fosforanu 100 mm. Stwierdzono, że działanie hamujące ma charakter konkurencyjny, a zmiany w Km nie mają wpływu na maksymalną aktywność enzymu. Czułość PDC na hamowanie przez fosforan oznaczono jako taką samą jak wrażliwość PDC na aktywację przez pirogronian.

Saccharomyces spp. i C. utilis są powszechnie stosowane do produkcji l-PAC; jednak we wczesnych pracach niewiele zrobiono w celu bezpośredniego porównania aktywności enzymów. PDCs S. cerevisiae i C. utilis porównali van Dijken i Scheffers (1986), oraz van Urk i wsp. (1989). Ustalono, że aktywność PDC z S. cerevisiae była około osiem razy większa niż PDC z C. utilis, chociaż PDC z pierwszego z nich uznano za bardziej wrażliwe na hamowanie przez fosforan. W odniesieniu do fosforanów PDC z C. utilis wykazywał podobne wartości Km do tych z S. carlsbergensis, a mianowicie 3.6 mm w przypadku braku fosforanu, a 11 mm w przypadku obecności fosforanu 100 mm. Natomiast PDC z S. cerevisiae wykazywało wartości Km 3,0 mm przy braku fosforanu i 48 mm w obecności fosforanu 100 mm. W związku z tym dostępność fosforanów odgrywa ważną rolę w aktywności PDC, a tym samym produktywności PDC. Van Urk i wsp. zaproponowali połączenie zmniejszenia stężenia fosforanu cytozolowego i zwiększenia stężenia pirogronianu. (1989) jako czynniki przyczyniające się do zwiększonej aktywności PDC po pulsowaniu Kultury glukozą. Proces używany przez Oliver et al. (1997) wiązało się z pulsowaniem melasy w połowie fermentacji, stąd podobny wzrost aktywności PDC najprawdopodobniej spowodowałby.

znaczące prace zostały podjęte przez Rogersa i współpracowników (Chow et al., 1995; Shin and Rogers, 1996a; Rogers et al., 1997) do oceny kinetyki PDC z C. utilis zarówno w postaci oczyszczonej, jak i w całych komórkach. Zanotowano aktywność PDC wynoszącą 0,85-0,9 U/mg białka dla całej biomasy w fazie stacjonarnej po wzroście w hodowli wsadowej. Po częściowym oczyszczeniu, Chow et al. (1995) odnotował wzrost aktywności PDC do 4,8 U/mg białka, co było porównywalne z komercyjnie uzyskanym PDC. Pohl (1997) sugeruje, że specyficzną aktywność w zakresie 45-60 U/mg można osiągnąć dla PDC oczyszczonego z drożdży i roślin.

(1997) przedstawił szereg parametrów kinetycznych dla oczyszczonego PDC z C. utilis. Wartości Km dla benzaldehydu i pirogronianu wynosiły odpowiednio 42 mm (4 °C, pH 7,0) i 2,2 mm (25 °C, pH 6,0), przy czym stężenia przekraczające 10 mm pirogronianu wymagane do uzyskania warunków nasycenia. Stała hamowania (Ki) aldehydu octowego wynosiła około 20 mm, podczas gdy hamowanie substratu było widoczne przy stężeniach benzaldehydu przekraczających 180 mm (19,1 g/l).

(1995) podjął badania w celu określenia kinetyki dezaktywacji PDC przez benzaldehyd. Ustalono, że dezaktywacja przebiegała zgodnie z kinetyką pierwszego rzędu dla benzaldehydu; jednak reakcja nie była liniowo związana z czasem dla stężenia benzaldehydu w przedziale od 100 do 300 mm.

w większości prac podejmowanych nad produkcją l-PAC stwierdzono, że PDC nie jest czynnikiem ograniczającym produkcję l-PAC (Vojtisek and Netrval, 1982; Shin and Rogers, 1996a; Tripathi et al., 1997), ponieważ część aktywności PDC pozostała pod koniec fermentacji. Przeciwnie, zarówno Tripathi i współpracownicy (1997) i Vojtisek i Netrval (1982) stwierdzili, że niskie stężenie pirogronianu w średniej ograniczonej wydajności. Enzymy glikolityczne były zaangażowane jako potencjalnie ograniczające szybkość zarówno przez Tripathi i współpracowników, jak i Nikolova i Warda (1991).

na podstawie powyższych informacji, warunki stosowane przez Oliver et al. (1997) (patrz sekcja 4) wydaje się bardzo sprzyjać produkcji l-PAC. Pirogronian występuje w znacznych ilościach i, według Hohmanna (1997), zdolność dehydrogenazy pirogronianowej jest ograniczona w porównaniu z PDC, ograniczając w ten sposób metabolizm pirogronianu jedyną alternatywną drogą. Ponadto biomasa jest uzupełniana węglowodanami w połączeniu ze zmniejszonym napowietrzaniem. The work of Sims and Barnett (1991) and Sims et al. (1991) wskazuje, że połączenie tych dwóch warunków sprzyja indukcji PDC.