2.2 Piruvato Descarboxilase e Fornecimento de Substratos

Conforme descrito acima, PDC é a enzima responsável pela produção de l-PAC. PDC é geralmente encontrado como dimers ou tetramers, onde o PDC holoenzima ativo geralmente existe como um tetrâmero, enquanto a apoenzima existe como um dímero (Pohl, 1997). A existência das formas dímero e tetrâmero é dependente do pH. Na levedura, PDC tem sido relatado existir apenas como um tetrâmero na gama de pH 5.5–6.5, as both tetramers and dimers at pH values up to 9.5, and dimers only at pH > 9.5 (Pohl, 1997). No entanto, Hohmann (1997) relatou a existência de PDC apenas na forma de dimers a um pH de 8.4. Apurou-se que o PDC de Z. mobilis existe apenas sob a forma de tetramers (Pohl, 1997). Enquanto as subunidades PDC eram pensadas anteriormente para ter composições diferentes, elas agora são conhecidas por serem idênticas (Hohmann, 1997).

Um total de seis PDC genes foi identificado em Saccharomyces cerevisiae, dos quais três são genes estruturais (PDC1, PDC5 e PDC6) e os três restantes são considerados genes com expressão de PDC (PDC2, PDC3, PDC4) (Flikweert et al., 1996; Hohmann, 1997; Pohl, 1997; ter Schure et al., 1998). Foi identificado um único código de genes estruturais para PDC em Z. mobilis (Pohl, 1997). Embora a maioria do trabalho nesta área pareça ter sido realizado em S. cerevisiae, genes para PDC foram identificados em um número de espécies de leveduras, não incluindo Candida utilis. A Flikweert e os colegas de trabalho realizaram estudos para avaliar o papel de cada uma das isoenzimas na actividade global da PDC, e descobriram que a expressão de cada uma das isoenzimas na S. cerevisiae diferia. Usando cultura de lote com etanol ou glicose como substrato de carbono, PDC1 foi expresso constitutivamente, enquanto PDC5 foi induzido na presença de glicose. O PDC6 estava presente em níveis insignificantes. Estes achados foram ecoados em uma revisão sobre as descarboxilases de piruvato por Hohmann (1997), que indicou que apenas PDC1 e PDC5 desempenharam um papel aparente no catabolismo do açúcar, com 80-90% e 10-20% da atividade PDC total sendo atribuída a estes dois genes, respectivamente, para biomassa cultivada com glicose.para além da produção de acetoína, verificou-se que o PDC de S. cerevisiae está envolvido na produção de óleos de fusel, que são compostos de sabor presentes em bebidas alcoólicas e pão. Os óleos de Fusel são produzidos pela descarboxilação de ácidos 2-oxo de cadeia ramificada, derivados de aminoácidos aromáticos. Os produtos são então desidrogenados pelo álcool desidrogenase (ADH). A actividade da PDC com os ácidos 2-oxo é significativamente inferior à do piruvato (ter Schure et al., 1998). A produção de novos análogos de aldeído é discutida mais tarde neste capítulo.a actividade PDC pode ser induzida e manipulada tanto pelo grau de arejamento fornecido à cultura como pela escolha do substrato de hidratos de carbono no meio. A actividade PDC é necessária para permitir o fluxo glicolítico apenas em condições anaeróbias; por conseguinte, uma redução na arejamento deve resultar na indução da PDC. Tanto Sims quanto co-trabalhadores (1991) e Rogers et al. (1997) demonstraram que se verifica um aumento da actividade da C. utilis PDC quando a concentração de oxigénio é reduzida. Tal resposta é altamente benéfica para a produção de l-PAC. No entanto, ambos os grupos de pesquisadores descobriram que a atividade da ADH, responsável pela geração de subprodutos indesejados, excede a de PDC em condições anaeróbicas ou parcialmente anaeróbicas. O efeito das condições de arejamento na fisiologia da levedura é discutido mais tarde neste capítulo.a indução da actividade da PDC por fonte de hidratos de carbono depende das espécies de leveduras envolvidas e da fonte de hidratos de carbono fornecida. A Glucose é um substrato capaz de induzir enzimas glicolíticas, especialmente PDC. Vários trabalhadores demonstraram que a adição de glucose às culturas resulta num aumento do nível de actividade dos PDC. Maitra e Lobo (1971) descobriram que a adição de glicose como um pulso para Saccharomyces spp. as culturas resultaram num aumento da produção de enzimas glicolíticas, incluindo PDC, após um curto período de desfasamento. O meio utilizado para o crescimento era isento de hidratos de carbono e o acetato era utilizado como fonte de carbono. Da mesma forma, Schmitt e Zimmerman (1982) demonstraram um aumento de 18 vezes na atividade PDC de S. cerevisiae após a adição de glucose a uma cultura de frasco agitado cultivado com etanol como única fonte de hidratos de carbono. Estes resultados estão de acordo com os de Harrison (1972) e Sims et al. (1991). Os Sims e os colegas de trabalho demonstraram também a natureza reversível da activação dos PDC. Eles mostraram que, em condições anaeróbias, quando Privado de glicose (por centrifugação e ressuspender biomassa em meio livre de glicose) a atividade PDC de C. utilis foi reduzida em 50%. A atividade PDC foi restaurada pela adição de glicose ao meio em condições anaeróbias; no entanto, se a cultura foi aerada, além de suplementação de glicose, não houve alteração na atividade PDC. Esta activação enzimática não ocorre para todos os tipos de hidratos de carbono. Quando as espécies de leveduras são cultivadas anaeróbicamente sobre glicosídeos que produzem o efeito de Kluyver, a actividade da PDC é reduzida em comparação com os glicosídeos, tais como a glucose, que pode ser metabolizada anaeróbia (Sims e Barnett, 1991). Como resultado de sua pesquisa, eles descobriram que a atividade PDC pode ser limitada em condições anaeróbicas. Esta conclusão está de acordo com a de van Urk et al. (1989).

PDC é uma enzima activada pelo substrato-piruvato (Hubner et al., 1978; Hohmann, 1997), que também é alostericamente inibido pelo fosfato inorgânico (Boiteux e Hess, 1970). Boiteux e Hess relataram um aumento da constante de Michaelis (Km) de PDC purificado de S. carlsbergensis de 1,3 mm na ausência de fosfato inorgânico para aproximadamente 11 mM na presença de fosfato de 100 mm. O efeito inibitório foi determinado para ser competitivo por natureza, a variação em Km não tem efeito na actividade máxima da enzima. A sensibilidade da PDC à inibição pelo fosfato foi determinada como sendo da mesma ordem de magnitude que a sua sensibilidade à activação pelo piruvato.Saccharomyces spp. e C. utilis são comumente utilizados para a produção de l-PAC; no entanto, no início do trabalho, pouco foi feito para comparar diretamente as atividades enzimáticas. Os PDCs de S. cerevisiae e C. utilis foram comparados por van Dijken e Scheffers (1986), e van Urk et al. (1989). Determinaram que a actividade da PDC da S. cerevisiae foi aproximadamente oito vezes superior à da PDC da C. utilis, embora se tenha determinado que a PDC da primeira era mais sensível à inibição pelo fosfato. No que diz respeito ao fosfato, o PDC de C. utilis apresentava valores Km semelhantes aos da S. carlsbergensis, ou seja, 3.6 mm na ausência de fosfato e 11 mm na presença de fosfato de 100 mm. Em contraste, a PDC de S. cerevisiae exibiu valores Km de 3, 0 mm na ausência de fosfato e 48 mm na presença de fosfato de 100 mm. Consequentemente, a disponibilidade de fosfato desempenha um papel importante na actividade do PDC e, por conseguinte, na produtividade do PDC. Foi proposta por van Urk et al uma combinação de redução da concentração citosólica de fosfato e do aumento das concentrações de piruvato. (1989) como factores que contribuem para o aumento da actividade dos PDC depois de pulsar a cultura com glucose. O processo utilizado por Oliver et al. (1997) envolveu a pulsação com melaços a meio da fermentação, pelo que um aumento semelhante da actividade dos PDC teria provavelmente resultado.

trabalho significativo tem sido realizado por Rogers e colegas de trabalho (Chow et al., 1995; Shin and Rogers, 1996a; Rogers et al., 1997) para avaliar a cinética da PDC a partir de C. utilis, tanto na forma purificada como em células inteiras. Eles registraram atividades PDC de 0,85-0,9 U / mg de proteína para biomassa em fase estacionária inteira após o crescimento na cultura de lotes. Após purificação parcial, Chow et al. (1995) registou um aumento da actividade dos PDC para 4, 8 U/mg de proteína, o que foi comparável com os PDC obtidos comercialmente. Pohl (1997) sugere que pode ser alcançada uma actividade específica na gama de 45-60 U/mg para PDC purificada a partir de leveduras e plantas.Rogers et al. (1997) reported a number of kinetic parameters for purified PDC from C. utilis. Os valores Km para o benzaldeído e o piruvato foram de 42 mm (4 °C, pH 7,0) e 2,2 mm (25 °C, pH 6,0), respectivamente, com concentrações superiores a 10 mm de piruvato necessárias para dar condições de saturação. A constante de inibição (Ki) para o acetaldeído foi de aproximadamente 20 mm, enquanto a inibição do substrato foi evidente em concentrações de benzaldeído superiores a 180 mm (19, 1 g/l).Chow et al. (1995) realizou estudos para determinar a cinética da desactivação do PDC pelo benzaldeído. Eles determinaram que a desativação seguiu cinética de primeira ordem para o benzaldeído; no entanto, a resposta não foi linearmente relacionada com o tempo para concentrações de benzaldeído entre 100 e 300 mm.

em grande parte do trabalho realizado sobre a produção de l-PAC, PDC não foi considerado o fator limitante da produção de l-PAC (Vojtisek e Netrval, 1982; Shin e Rogers, 1996a; Tripathi et al., 1997) uma vez que alguma atividade PDC permaneceu no final das fermentações. Em vez disso, tanto Tripathi como co-trabalhadores (1997) e Vojtisek e Netrval (1982) descobriram que a baixa concentração de piruvato nos rendimentos médios limitados. As enzimas glicolíticas foram implicadas como potencialmente limitadoras de taxa tanto por Tripathi quanto por colegas de trabalho, e Nikolova e Ward (1991).com base nas informações acima, as condições utilizadas por Oliver et al. (1997) (ver secção 4) parecem ser muito favoráveis à produção de carvão activado em pó. O piruvato está presente em quantidades significativas e, de acordo com Hohmann (1997), a capacidade de piruvato desidrogenase é limitada em comparação com a PDC, restringindo assim o metabolismo do piruvato através da única via alternativa. Além disso, a biomassa é complementada com hidratos de carbono em combinação com arejamento reduzido. The work of Sims and Barnett (1991) and Sims et al. (1991) indica que a combinação destas duas condições conduz à indução de PDC.