ritmul de escaladare la care sunt finalizate proiectele de secvențiere a genomului a crescut nevoia de metode cu randament ridicat pentru controlul expresiei genelor. O posibilă abordare este utilizarea oligonucleotidelor antisens pentru a lega ARNm și a preveni sinteza proteinelor. În teorie, această strategie permite progresul rapid de la sinteza oligomerilor la observarea fenotipului . În practică, tehnologia antisens a fost afectată de o tendință de interacțiuni nespecifice, iar acestea au încetinit aplicarea sa largă la investigațiile biologice . Recent, însă, îmbunătățirile proprietăților chimice ale oligonucleotidelor și înțelegerea mecanismului lor de acțiune s-au combinat pentru a face utilizarea lor cu succes mai probabilă. Lucrările de la mai multe laboratoare sugerează acum că oligonucleotidele morfolino pot fi microinjectate în embrioni de pește zebră , arici de mare sau Xenopus , unde blochează expresia genelor și produc efecte fenotipice în primele etape ale dezvoltării.

oligonucleotidele Morfolino sunt analogi ADN neionici disponibili de la Gene Tools LLC . Ei posedă legături de coloană vertebrală modificate în comparație cu ADN-ul sau ARN-ul (Figura (Figura 1).1). În ciuda coloanei vertebrale modificate, morfolinii se leagă de secvențele complementare de acid nucleic prin asocierea bazei Watson-Crick. Această legare nu este mai strânsă decât legarea analogului ADN și ARN oligomeri, necesitând utilizarea morfolinilor relativ lungi de 25 de baze pentru inhibarea genei antisens. Coloana vertebrală face morfolinos rezistent la digestie de nucleaze. De asemenea, deoarece coloana vertebrală nu are sarcină negativă, se crede că morfolinii sunt mai puțin susceptibili să interacționeze neselectiv cu proteinele celulare; astfel de interacțiuni adesea ascund observarea fenotipurilor informative. Punctele forte ale morfolinos ca instrumente pentru investigarea dezvoltării vertebratelor sunt bine descrise într-o revizuire recentă de Ekker . Cel mai mare avantaj al acestora este că fenotipurile pot fi observate rapid la animalele F0 folosind o metodă relativ ieftină.

structuri de ADN și oligonucleotide morfolino. R și R ‘denotă continuarea lanțului oligomer în direcția 5′ sau respectiv 3’.

un obstacol major în calea utilizării oligonucleotidelor antisens este alegerea unei secvențe țintă. Oligonucleotidele antisens care conțin ADN sunt capabile să formeze hibrizi ARN-ADN. Acești hibrizi pot acționa ca un substrat pentru Rnaza H, care promovează scindarea țintei ARNm. Deoarece ARN-ul este degradat, orice secvență din regiunea de codificare a genei țintă are potențialul de a fi un site antisens util. Morfolinos, în schimb, formează hibrizi ARN-morfolino care nu sunt substraturi pentru Rnaza H și, prin urmare, ARNm nu este degradat. Acesta este un aspect important, deoarece morfolinos vizat în cea mai mare parte a regiunii de codificare va fi deplasat de ribozom pe măsură ce se translocă de-a lungul ARNm și, prin urmare, va fi ineficient în prevenirea traducerii. Oligonucleotidele morfolino direcționate către regiunea 5 ‘ – netradusă (UTR) sau codonul de pornire ar putea funcționa preferențial, împiedicând legarea mașinilor de traducere, dar nu există nicio garanție că aceasta este o regulă generală și va trebui demonstrată empiric pentru fiecare genă țintă.Ekker și colegii săi au raportat că oligonucleotidele morfolino marcate fluorescent pot fi injectate în embrioni de pește zebră în stadiu de sferă și pot obține o distribuție uniformă. Oligomerii morfolino vizați de codonul de pornire pentru proteina fluorescentă verde (GFP) au blocat expresia GFP, în timp ce oligomerii de control care sunt complementari GFP nu au făcut-o. Nivelul ARNm GFP nu a fost modificat, ceea ce este de așteptat dacă RNase H nu este implicat. Aceste experimente model sunt semnificative deoarece stabilesc capacitatea oligomerilor morfolino de a bloca fără echivoc expresia genelor într-o manieră specifică secvenței. Ekker și colegii săi raportează, de asemenea, inhibarea mai multor gene endogene de pește zebră și au început să compileze o bază de date care detaliază fenotipurile produse de oligonucleotidele morfolino .căile investigate de Ekker și colegii săi folosind morfolinos includ semnalizarea dezvoltării prin ligandul arici Sonic și efectul VEGF-o expresie a genei factorului de creștere angiogen asupra angiogenezei. În general, Laboratorul Ekker a observat fenotipuri interesante în 16 din cele 17 gene vizate . Hammerschmidt și colegii săi au investigat morfolinos orientat către gena receptorului serină/treonin kinazei de tip I Alk8 / lost-a-fin. Lin și colegii săi au raportat că inhibarea cu morfolinos de fez, care codifică o proteină cu deget de zinc, poate reduce expresia dlx2, care codifică o proteină care conține homeodomain, în creierul ventral. În cazul în care au fost examinate nivelurile de Expresie, s-au obținut ‘eliminări’ semnificative ale expresiei genelor (până la 90%).

în alte organisme decât peștele zebră, Angerer și colegii săi au folosit morfolinos conceput pentru a bloca traducerea SpKr1, un factor de transcripție țintă pentru reglarea cateninei de la sută, în embrionii de arici de mare . Ca și în lucrarea lui Nasevicius și colab. , un’ knockdown ‘ al expresiei GFP a fost folosit ca un control pozitiv, iar introducerea morfolino-ului anti-spkr1 de 4 mm a dus la eșecul endodermului de a se diferenția. Heasman și colab. au studiat semnalizarea cu catenină în Xenopus . Injecția în stadiul cu 2 sau 4 celule blochează formarea axei dorsale, în timp ce injecția în stadiul cu 8 celule blochează formarea capului . În cele din urmă, Erickson și colegii săi au folosit electroporația pentru a livra morfolinos îndreptate împotriva FoxD3 embrionilor de pui. FoxD3 este un factor de transcripție din clasa helixului înaripat, iar introducerea morfolinilor modifică progresul celulelor crestei neuronale, rezultat în concordanță cu localizarea FoxD3 . Aceste experimente ilustrează potențialul morfolinos de a diseca fin progresia temporală a dezvoltării. Atunci când blocați o genă cu funcție necunoscută sau când observați un rezultat neprevăzut, este important să rețineți, totuși, că noul fenotip nu se datorează neapărat reducerii expresiei genei țintă. Această avertizare este prezentă și pentru knockout-urile genetice standard și implică pur și simplu că rezultatele ar trebui interpretate cu precauție.

aceste date sunt provocatoare și sugerează că, cel puțin în aceste modele animale, oligomerii antisens morfolino pot deveni instrumente de rutină pentru generarea fenotipurilor mutante. Este esențial să ne dăm seama, totuși, că tehnologia antisens rareori, dacă vreodată, duplică mutații complete de pierdere a funcției. De asemenea, avertizăm că reactivii antisens au fost folosiți pe scară largă în trecut. Controalele au lipsit, rezultatele sunt adesea marginale, iar fenotipurile observate s-au dovedit adesea a fi datorate unei largi varietăți de mecanisme neașteptate non-antisens. Cauzele acestor efecte non-antisens includ interacțiuni neintenționate cu proteinele și legarea la secvențe de acid nucleic non-țintă . Prin urmare, este imperativ ca metodologia să fie aplicată cu atenție pentru a evita repetarea greșelilor din trecut care au încetinit progresul tehnologiei antisens.ca și în cazul oricărui experiment antisens, controalele riguroase pentru efectele nespecifice sunt esențiale pentru interpretarea corectă a fenotipurilor. Experimentele care utilizează oligonucleotide morfolino trebuie să testeze întotdeauna cel puțin o nepotrivire și un oligomer de control amestecat, iar rezultatele acestor teste trebuie raportate. Testele doză-răspuns pentru a determina marja dintre inducerea unui fenotip specific și debutul toxicității sunt, de asemenea, importante. De exemplu, această marjă poate fi mai mică de două ori, subliniind necesitatea unei determinări atent controlate a dozei și a unei livrări precis cuantificate. Ori de câte ori este posibil, nivelurile atât ale proteinei țintă, cât și ale uneia sau mai multor proteine de control trebuie evaluate în probe tratate cu morfolinos experimental și de control. În plus, Ekker sugerează ca rezultatele să fie confirmate prin salvarea ARNm și/sau prin comparație cu fenotipurile mutanților existenți .

rata ridicată de succes pentru inhibarea expresiei genelor de către oligonucleotidele morfolino este surprinzătoare. Dogma în domeniul antisens este că direcționarea site-ului de pornire ATG nu este o anumită rețetă pentru succes și că poate fi necesar să fie testate până la 40 de oligonucleotide pentru a identifica una care inhibă eficient expresia genelor . Dacă direcționarea codonului start funcționează atât de bine, de ce mai mulți anchetatori nu fac acest lucru decât să recurgă la ecrane elaborate? Morfolinos poate fi mai eficient decât alte substanțe chimice antisens, dar de ce? Această din urmă întrebare va trebui abordată Prin investigarea sistematică a proprietăților lor și compararea cu alte tipuri de oligonucleotide. Coloana vertebrală morfolino modificată dramatic se poate lega mai eficient de ARNm sau poate acționa ca un bloc mai bun al traducerii. Dacă da, morfolinii ar putea fi agenți superiori pentru inhibarea genei în raport cu alte tipuri de oligomer care ar putea bloca traducerea, cum ar fi acidul nucleic blocat (LNA), acidul nucleic peptidic (PNA) sau ARN modificat cu 2′. Pe de altă parte, alte tipuri de oligomer ar putea funcționa la fel de bine sau mai bine decât morfolinos, dar potențialul lor poate fi mai puțin evident, deoarece nu au fost testate în sisteme experimentale favorabile.

observațiile înșelătoare rezultate din interacțiunile nespecifice au confundat multe cercetări anterioare folosind oligonucleotide . Aceste dificultăți au determinat mulți cercetători să fie sceptici cu privire la utilizarea oligonucleotidelor ca instrument de cercetare de bază. Lucrările publicate în ultimele 18 luni sugerează, totuși, că oligomerii morfolino pot avea proprietăți care permit cercetătorilor să genereze în mod obișnuit fenotipuri instructive. Rezultatele sunt interesante, cu implicația că oligomerii morfolino ar putea oferi un instrument general aplicabil pentru genetica chimică și genomica funcțională. Pentru a realiza acest potențial, trebuie determinate proprietățile care guvernează eficacitatea acestor reactivi. Aceste informații vor permite cercetătorilor să optimizeze metodologia și să obțină o eliminare maximă a unei ținte date, minimizând în același timp efectele confuze, nespecifice. Utilizatorii oligomerilor morfolino trebuie să înțeleagă problemele care au afectat câmpul antisens în trecut, să învețe din aceste eșecuri și să efectueze experimente de control adecvate. Aceste experimente de control, cel puțin la fel de mult ca și producția de fenotipuri interesante, vor determina dacă oligonucleotidele morfolino sunt descoperirea pe care o sugerează cercetările recente.