stupňující tempo, které sekvenování genomu projekty jsou dokončeny, zvýšila potřebu high-propustnost metody pro řízení genové exprese. Jedním z možných přístupů je použití antisense oligonukleotidů k vazbě mRNA a prevenci syntézy proteinů. Teoreticky tato strategie umožňuje rychlý pokrok od syntézy oligomerů k pozorování fenotypu . V praxi byla antisense technologie sužována sklonem k nespecifickým interakcím, které zpomalily její široké uplatnění v biologických vyšetřováních . V poslední době se však zlepšení chemických vlastností oligonukleotidů a v našem chápání jejich mechanismu účinku spojily, aby bylo jejich úspěšné použití pravděpodobnější. Práce z počtu laboratoří nyní naznačuje, že morfolinové oligonukleotidy mohou být microinjected do danio pruhované , mořský ježek nebo embryí Xenopus , kde se blokují expresi genu a vyrábět fenotypové účinky během raných fázích vývoje.

Morfolino oligonukleotidy jsou neiontové analogy DNA dostupné od Gene Tools LLC . Mají změněné páteřní vazby ve srovnání s DNA nebo RNA (obrázek (obr. 1).1). Přes jejich změněnou páteř, morfoliny se vážou na komplementární sekvence nukleových kyselin pomocí párování bází Watson-Crick. Tato vazba není těsnější než vazba analogických DNA a RNA oligomerů, což vyžaduje použití relativně dlouhých 25-bazických morfolinů pro inhibici antisense genu. Páteř činí morfoliny odolné vůči trávení nukleázami. Také proto, že páteř postrádá negativní náboj, předpokládá se, že morfoliny jsou méně pravděpodobné, že interagují neselektivně s buněčnými proteiny; takové interakce často zakrývají pozorování informativních fenotypů. Silné stránky morpholinos jako nástroje pro zkoumání vývoje obratlovců jsou dobře popsány v nedávném přehledu Ekker . Jejich největší výhodou je, že fenotypy lze rychle pozorovat u zvířat F0 pomocí relativně levné metody.

struktury DNA a morfolino oligonukleotidů. R A R‘ označují pokračování oligomerního řetězce ve směru 5′ nebo 3′.

hlavní překážkou použití antisense oligonukleotidů je volba cílové sekvence. Antisense oligonukleotidy, které obsahují DNA, jsou schopny tvořit hybridy RNA-DNA. Tyto hybridy mohou působit jako substrát pro Rnázu H, která podporuje štěpení cíle mRNA. Protože je RNA degradována, má každá sekvence v kódující oblasti cílového genu potenciál být užitečným antisense místem. Morfoliny naproti tomu tvoří RNA-morfolino hybridy, které nejsou substráty pro Rnázu H, a mRNA tedy není degradována. To je důležité hledisko, protože morfoliny zaměřené na většinu kódující oblasti budou přemístěny ribozomem, jak se translokuje podél mRNA, a proto bude neúčinné při prevenci translace. Morfolinové oligonukleotidy cílené na 5′-untranslated region (UTR) či start kodonu může pracovat přednostně, tím, že brání překladu strojů z vazby, ale neexistuje žádná záruka, že to je obecné pravidlo, a to bude muset být prokázána empiricky pro každý cílový gen.

Ekker a jeho kolegové uvádějí, že fluorescenčně značené morfolino oligonukleotidy mohou být injikovány do embryí zebrafish ve sféře a dosáhnout rovnoměrné distribuce. Morfolino oligomery zaměřené na počáteční kodon pro zelený fluorescenční protein (GFP) blokovaly expresi GFP, zatímco kontrolní oligomery, které jsou komplementární k GFP, ne. Hladina GFP mRNA nebyla změněna, což se očekává, pokud se nejedná o Rnázu H. Tyto modelové experimenty jsou významné, protože stanovují schopnost morfolino oligomerů jednoznačně blokovat genovou expresi sekvenčně specifickým způsobem. Ekker a jeho kolegové také hlásí inhibici několika endogenních genů zebrafish a začali sestavovat databázi podrobně popisující fenotypy produkované morfolino oligonukleotidy .

Cesty vyšetřován Ekker a kolegy pomocí morpholinos zahrnují vývojové signalizace prostřednictvím Sonic ježek ligand a účinek VEGF-angiogenní růstový faktor genové exprese na angiogenezi. Celkově ekkerova laboratoř pozorovala zajímavé fenotypy u 16 ze 17 cílených genů . Hammerschmidt a jeho kolegové zkoumali morfoliny zaměřené na gen receptoru serinu/threoninkinázy typu I Alk8 / Lost-a-fin. Lin a spolupracovníci uvádějí, že inhibice s morpholinos fez, který kóduje zinc-finger protein, může snížit expresi dlx2, který kóduje homeodomain-obsahující bílkoviny, do ventrální, přední mozek. Tam, kde byly zkoumány úrovně exprese, bylo dosaženo významných „knockdownů“ genové exprese (až 90%).

U jiných organismů, než danio pruhované, Angerer a jeho kolegové použili morpholinos navržen tak, aby blokovat překlad SpKr1, transkripční faktor cíl pro β-catenin nařízení, v mořského ježka embryí . Stejně jako v díle Naseviciuse a kol. ‚babku‘ ONZP výraz byl použit jako pozitivní kontrola a zavedení 4 µM anti-SpKr1 morfolinové za následek selhání endoderm rozlišovat. Heasman et al. studovali signalizaci β-kateninu v Xenopusu . Injekce ve 2-nebo 4-buněčném stádiu blokuje tvorbu hřbetní osy, zatímco injekce v 8-buněčném stadiu blokuje tvorbu hlavy . Nakonec Erickson a jeho kolegové použili elektroporaci k dodání morfolinů namířených proti FoxD3 kuřecím embryím. FoxD3 je transkripční faktor třídy okřídlené šroubovice a zavedení morfolinů mění průběh neurálních hřebenových buněk, což je výsledek v souladu s lokalizací FoxD3 . Tyto experimenty ilustrují potenciál morfolinů jemně pitvat časovou progresi vývoje. Při blokování genu neznámé funkce nebo při pozorování neočekávaného výsledku je však důležité mít na paměti, že nový fenotyp nemusí být nutně způsoben snížením exprese cílového genu. Tato námitka je také přítomna u standardních genetických knockoutů a jednoduše znamená, že výsledky by měly být interpretovány opatrně.

Tyto údaje jsou provokativní a naznačují, že alespoň v těchto zvířecích modelech, morfolino antisense oligomery mohou stát rutinní nástroje pro generování mutantních fenotypů. Je však nezbytné si uvědomit, že antisense technologie zřídka, pokud vůbec, duplikuje úplné mutace „ztráty funkce“. Upozorňujeme také na to, že antisense činidla byla v minulosti hojně zneužívána. Kontroly chyběly, výsledky jsou často okrajové, a bylo často zjištěno, že pozorované fenotypy jsou způsobeny širokou škálou neočekávaných ne antisenzních mechanismů. Příčiny těchto non-antisense účinků zahrnují nezamýšlené interakce s proteiny a vazbu na necílové sekvence nukleových kyselin . Je proto nezbytné, aby byla metodika uplatňována pečlivě, aby se zabránilo opakování minulých chyb, které zpomalily pokrok antisense technologie.

stejně jako u každého experimentu antisense jsou přísné kontroly nespecifických účinků rozhodující pro správnou interpretaci fenotypů. Experimenty s použitím morfolino oligonukleotidů by měly vždy testovat alespoň jeden nesoulad a jeden kódovaný kontrolní oligomer a výsledky těchto testů by měly být hlášeny. Důležité jsou také testy odpovědi na dávku pro stanovení rozpětí mezi indukcí specifického fenotypu a nástupem toxicity. Tato marže může být například menší než dvojnásobná, což zdůrazňuje potřebu pečlivě kontrolovaného stanovení dávky a přesně kvantifikovaného podání. Pokud je to možné, hladiny cílového proteinu i jednoho nebo více kontrolních proteinů by měly být hodnoceny ve vzorcích léčených experimentálními a kontrolními morfoliny. Kromě toho Ekker navrhuje, aby výsledky byly potvrzeny pomocí záchrany mRNA a / nebo porovnáním s fenotypy existujících mutantů .

vysoká úspěšnost inhibice genové exprese morfolino oligonukleotidy je překvapivá. Dogma v „antisense“ oblasti je, že cílení ATG start webu není jistý recept na úspěch, a to tolik, kolik 40 oligonukleotidy muset být testovány, aby identifikovat ten, který účinně inhibuje genovou expresi . Pokud cílení na start kodon funguje tak dobře, proč to více vyšetřovatelů neudělá, než aby se uchýlili k propracovaným obrazovkám? Morpholinos může být účinnější než jiné antisense chemie, ale proč? Druhá otázka bude muset být řešena systematické vyšetřování jejich vlastností a porovnání s jinými typy oligonukleotid. Dramaticky změněná páteř morfolina se možná může účinněji vázat na mRNA nebo působit jako lepší blok translace. Pokud ano, morpholinos mohl být vynikající přípravky pro genovou inhibice ve srovnání s jinými typy oligomer, které by mohly blokovat překlad, jako uzamčené nukleové kyseliny (LNA), peptidové nukleové kyseliny (PNA), nebo 2′-modifikované RNA . Na druhou stranu, ostatní typy oligomeru by mohlo fungovat stejně jako, nebo lepší než, morpholinos, ale jejich potenciál může být méně zřejmé, protože nebyly testovány v příznivých experimentální systémy.

zavádějící pozorování vyplývající z nespecifických interakcí zmátla mnoho předchozích výzkumů používajících oligonukleotidy . Tyto obtíže vedly mnoho vědců k tomu, aby byli skeptičtí ohledně použití oligonukleotidů jako nástroje pro základní výzkum. Práce publikované v průběhu posledních 18 měsíců však naznačují, že morfolino oligomery mohou mít vlastnosti, které umožňují výzkumníci běžně generovat poučné fenotypy. Výsledky jsou vzrušující, což znamená, že morfolino oligomery by mohly poskytnout obecně použitelný nástroj pro chemickou genetiku a funkční genomiku. K realizaci tohoto potenciálu je třeba určit vlastnosti, které řídí účinnost těchto činidel. Tyto informace umožní vědcům optimalizovat metodiku a dosáhnout maximálního „knockdownu“ daného cíle a zároveň minimalizovat matoucí nespecifické účinky. Uživatelé morpholino oligomerů musí pochopit problémy, které v minulosti trápily antisense pole, poučit se z těchto neúspěchů a provádět příslušné kontrolní experimenty. Tyto kontrolní experimenty, přinejmenším stejně jako produkce zajímavých fenotypů, určí, zda jsou morfolino oligonukleotidy průlomem, který naznačuje nedávný výzkum.