Acinetobacter baumannii (A. baumannii) způsobuje infekce získané v nemocnici (HAI), například ventilátorové pneumonie, bakteriémie, infekce močových cest, meningitidy a infekce chirurgických ran , což vede k zvýšení mortality u pacientů. Mezi rizikové faktory těchto infekcí patří mechanická ventilace, použití širokospektrých antibiotik, doba pobytu na JIP a kóma . Statisticky, asi 1 000 000 lidí na celém světě byly infikovány A. baumannii každý rok, a polovina z těchto infekcí způsobených multirezistentní (MDR) kmenům . Úmrtnost infekce a. baumannii na JIP byla 45~60%, dokonce dosáhla 84,3%, když byli pacienti infikováni rozsáhlou lékovou rezistencí (XDR) a .baumannii. V roce 2017, karbapenem-rezistentní a. baumannii (KRAB) na prvním místě z hlediska ohrožení lidského zdraví a naléhavosti rozvoje příslušných antibiotik, podle drog-rezistentní bakterie seznamu vydané WHO .

Nicméně, kolistin (CST) a tegacycline, nejčastěji používaných antibiotik proti enterobakterií produkujících GNB, se staly neefektivní vzhledem k rezistenci na antibiotika . Aby bylo dosaženo klinické účinnosti, lékaři museli zvýšit dávku CST a kombinovat ji s tegacyklinem . Bohužel pro bakterémii a závažné infekce dýchacích cest způsobené krabem a XDR-a. baumannii, v uvedeném pořadí, kombinovaná léčba stále nefunguje efektivně . Čelí vážné bakteriální rezistence, vědci si uvědomil, že je naléhavě nutné vyvinout nové antibakteriální strategií, spíše než se spoléhat na tradiční antibiotika.

obecně existují dva způsoby, jak navrhnout nová antimikrobiální činidla. Jeden je, že inhibují produkci základní látka pro bakterie přežití, druhá je pro inhibici faktorů virulence nebo geny antibiotické rezistence patogenních bakterií za účelem potlačení patogenity nebo zlepšit jejich citlivost na antibiotika . Inhibice jediné základní složky však nevyhnutelně přináší velký evoluční tlak na bakterie a podporuje vývoj kmenů rezistentních na léky na vysoké úrovni . Nová intervenční strategie zaměřená na neenzenciální procesy je proto klíčem k překonání bakteriální rezistence . Například inhibice Abai / AbaR quorum sensing systémů s přírodním nebo syntetickým inhibitorem blokuje komunikaci mezi bakteriemi a inhibuje tvorbu biofilmů. Jako třída důležitých faktorů virulence v bakteriích přitahovaly vnější membránové proteiny (Omp) mnohem více pozornosti.

Omp jsou třídou jedinečných integrálních membránových proteinů ukotvených v OM, jejichž β-barelové struktury byly tvořeny 8 až 26 vlákny. Mezi prameny na extracelulární straně a krátkými smyčkami na periplazmatické straně jsou velké, prodloužené smyčky. Tyto vlastnosti dávají OMPs vysokou stabilitu v membráně a schopnost bojovat proti extrémně drsným prostředím . Ačkoli různé Omp mají různé sekvence a funkce, sdílejí podobnou strukturu a biologické vlastnosti . OMP bakterií se skládají z sudých číselných řetězců, a co je důležité, funkce a počet smyků závisí na jejich sekvencích. Například, jako je virulence související proteiny, komplement vázající protein OmpX v E. coli a fibronektinu – a heparin-vázající protein Všechno v Yersinia pestis sdílet srovnatelné podobnou strukturu, ale jejich identita sekvence byla nižší než 45%. Rozmanitost OMPs sekvence se vyskytuje na N terminálu podstatně více, než C terminálu, a konzervované β signál ovládá skládání a správné sestavení OMPs .

dosud však typy Omp V A. baumannii nebyly jasně identifikovány a bylo k dispozici pouze několik rozptýlených zpráv, zejména Bama, LptD, Omp33–36, OmpW. CarO a OprD. Samotná BamA jako OMP může automaticky vložit do OM a je zodpovědná za sestavení dalších Omp ; LptD zprostředkovává přepravu LPS vnější membrána (OM), ztráta, která může způsobit hromadění meziproduktů a chyba umístění LPS, a nakonec vést k narušení bakteriální buněčné integrity ; Omp33–36 je kanál pro průchod vody, který může indukovat apoptózu hostitelských buněk tím, že aktivuje kaspázy a regulaci autofagie ; OmpW je druh hydrofobní porin existující v OM a cytoplasmě, a hraje důležitou roli v modulaci homeostázy železa iontů v bakteriích ; CarO a OprD jsou spojeny s rezistencí na karbapenem .

mezi těmito Omp a. baumannii, OmpA je nejvíce hluboce studoval faktor virulence, který hraje klíčovou roli v regulaci přilnavosti, agresivita, a biofilmu tvorba A. baumannii a imunitní odpovědi hostitele. Nadprodukce OmpA je nezávislým rizikovým faktorem úmrtnosti nozokomiální pneumonie a bakterémie způsobené a. baumannii . Kromě toho, hladina exprese OmpA měří zásahovou jednotku-PCR může být použit jako rychlý diagnostický index pro rezistentní vůči antibiotikům A. baumannii, které výsledky jsou velmi konzistentní s těmi, přes tradiční MIC analýzy .

Tento přehled shrnul strukturu, funkci a patogenezi Abompy, shrnul terapeutické strategie zaměřené na Abompu a zdůraznil, proč je AbOmpA potenciálním cílem léčby a. baumannii.

OmpA struktury a funkce

OmpA byl poprvé identifikován jako tepelně upravitelné proteinů v Escherichia coli (E. coli) v roce 1974 a původně čištěná v roce 1977. Jeho molekulová hmotnost se pohybuje od 28 kDa do 36 kDa . Rodina OmpA je skupina povrchově exponovaných porinových proteinů s vysokým počtem kopií v Omp GNB. N-terminální doména OmpA je antiparalelní β-barel strukturu, skládající se z osmi transmembránový prameny tak, aby být vložen do vnější membrány. Osm pramenů jsou spojeny čtyři dlouhé smyčky na povrchu vnější membrány a tři krátké zatáčky v periplasmic domény tvořící kulovitý C-terminál . I ve specifickém bakteriálním kmeni jsou aminokyselinové sekvence OmpA různé mezi více podtřídami .

V posledních letech, s objasněním nativní struktura AbOmpA, vědci zjistili, že aminokyseliny z AbOmpA z různých klinických izolátů jsou vysoce konzervované (> 89%), zatímco oni nejsou homologní s lidskou proteomu . Porovnáním různých OmpA-jako bílkoviny, dva konzervativní aminokyseliny, R286 a Asp271, které se nacházejí v C-terminální doméně OmpA, byly identifikovány. Obě aminokyseliny se nekovalentně vážou na diaminopimelátovou aminokyselinu (DAP), složku peptidoglykanu (PGN). Tato interakce naznačuje, že OmpA hraje klíčovou roli při udržování integrity bakteriálního povrchu. Obecně platí, že v GNB druhů, OmpA stabilizovat jejich strukturu self-dimerizace, která zabraňuje ohýbání spojení mezi β-barel struktury a periplasmic od lyse .

AbOmpA je zásadní pro A. baumannii dodržovat a invazi do epitelových buněk

A. baumannii je schopen vstupem a setrváním uvnitř hostitelských buněk. Za prvé, přilne k hostitelským buňkám, pak napadne a přemění se do jádra. Po zabití hostitelských buněk se šíří v krevním řečišti a tkáních . AbOmpA zprostředkovává adhezi a invazi a. baumannii do epiteliálních buněk (obr. 1a, horní panel). Ve srovnání s bakteriemi divokého typu je isogenní kmen AbOmpA-mutant obtížnější napadnout hostitelské buňky. Preinkubace rekombinantní AbOmpA (rAbOmpA) dramaticky inhibuje adhezi a invazi vysoce invazivního a.baumannii 05KA103 do epiteliálních buněk. A in vivo je patogeneze zpožděna mutací Abompy, protože důkazy ukázaly, že menší bakteriální zátěž v krvi modelu myší pneumonie . Pro adhezní mechanismus OmpA, Smani et al. zjistil, že to bylo mnohem jednodušší pro A. baumannii připojit 96jamkové desky potažené fibronection než potažené BSA, a byly identifikovány proteiny s fibronection byl OmpA, což naznačuje, že vazba OmpA na firbronectin byl první krok interakce mezi A. baumannii s hostitelských buněk.

br. 1

funkce OmpA V A.baumannii. horní panel. Při kontaktu s epiteliálními buňkami bakterie do těchto buněk vylučují OmpA. Na OmpA jsou schopny se přemisťovat v jádře a mitochondriích, a stimulaci mitochondrií, uvolnění cytochromu c. Pak cytochromu c podporuje apoptózu vyvolávající faktor (AIF) přemisťovat do jádra a nakonec způsobuje apoptózu epiteliálních buněk. Spodní panel. OmpA zvyšuje produkci syntázy oxidu dusnatého (iNOS) a povrchovou expresi Toll-like receptoru 2 (TLR2) v epiteliálních buňkách, které spouštějí smrt hostitelských buněk. b při nízké koncentraci OmpA aktivuje DCs, které pak stimuluje CD4+T buňky k vyvolání Th1 odpovědi, zatímco při vysoké koncentraci; OmpA zabíjí DCs vyvoláním mitochondrií k uvolnění ROS. c AbOmpA může zastavit sérový faktor H v séru, což způsobuje ochrnutí odpovědi komplementu. d AbOmpA hraje dominantní roli při připojování abiotických povrchů a vytváření biofilmové matrice. e AbOmpA je protein porin, který vyhledá ve vnější membráně selektivně umožňuje pronikání malých molekulárních sloučenin,

AbOmpA může přímo způsobit hostitelských buněk smrti, pokud bude doručeno na hostitelské buňky přes vnější membránu váčků (OMVs) . Jak je znázorněno na obr. 1a, po vstupu do hostitelské buňky, AbOmpA lze lokalizovat do mitochondrií, což vede k uvolnění molekuly (jako je cytochrom C, apoptózu vyvolávající faktor (AIF)) V rané fázi A. baumannii infekce, AIF degraduje chromozomální DNA a usnadňuje apoptózy epiteliálních buněk . Kromě toho, OmpA může také přemístit do jádra hostitelských buněk v závislosti na jeho monopartite jaderný lokalizační signál (NLS)-„KTKEGRAMNRR“, která se nachází mezi zbytky 320 a 330 OmpA. Toto subcelulární cílení rabompy může indukovat apoptózu hostitelských buněk, ale specifický základní mechanismus není jasný . rAbOmpA čistí od A. baumannii ATCC19606 na koncentrace 6 µg/mL je dostačující vyvíjet cytotoxicity na lidských epitelu hrtanu HEp-2 buněk . AbOmpA podporuje A. baumannii, aby dodržovali a invazi do hostitelských buněk, což vede k jejich smrti lokalizaci do mitochondrií a jádra, ale zda AbOmpA funguje v jiných organel nadále být prozkoumány.

abompa stimuluje vrozenou imunitní odpověď

AbOmpA také ovlivňuje imunitní systém hostitele. I když AbOmpA léčba nemá vliv na úroveň exprese pro-zánětlivých cytokinů nebo chemokinem, to zvyšuje produkci oxidu dusnatého (iNOS) a povrchová exprese Toll-like receptor 2 (TLR2) v HEp-2 buněk (Obr. 1a, dolní panel). Oba jsou důležité v mechanismu hostitelské obrany. Oxid dusnatý (NO) vykazuje bakteriostatické a baktericidní funkce při plicní infekci a tento oxidační stres poskytuje další kauzální faktor buněčné smrti. A TLRs rozpoznává molekulární vzorce spojené s patogenem (PAMP) a spouští imunitní odpověď . Účinky přípravku AbOmpA na dendritické buňky odvozené od kostní dřeně (DCs)jsou ilustrovány na obr. 1b. AbOmpA v koncentraci 200 ng/mL aktivuje DCs cestou TLR2, MAPK a NF-kB a stimuluje CD4+T buňky směrem k odpovědi Th1 . Avšak AbOmpA má tendenci zabíjet DCs při vysokých koncentracích (≥3 µg / mL) zvýšením reaktivních druhů kyslíku (ROS) z mitochondrií . Očkování přípravkem rAbOmpA by mohlo vyvolat imunitní odpověď typu 2 u myší, což poškodilo rovnováhu mezi IL-4 a INF-c a vedlo k výskytu infekce . Kromě toho AbOmpA paralyzovala systém reakce komplementu zastavením sérového faktoru H (obr. 1c).

AbOmpA indukuje tvorbu biofilmu

Biofilm umožňuje A. baumannii přežít v nepřátelské podmínky , skládající se převážně z bílkovin, extracelulární DNA a polysacharidů. Podle statistik National Institutes of Health a Centra pro nemoci a prevenci bylo 65-80% lidských infekcí způsobeno bakteriemi tvořícími biofilm . Na základě multi-funkční charakteristiky biofilmu formace, řady genů spojených s bakteriální adhezi a tvorbu biofilmu byly identifikovány, jako AbOmpA, beta-laktamázu PER-1 (blaPER-1) a biofilm-associated protein (Bap) . OmpA a. baumannii ATCC19606 skutečně hraje dominantní roli při vytváření stabilního biofilmu na plastovém povrchu (obr. 1d). Abompa mutantní kmeny nedokáží tvořit biofilm, zatímco doplňování alely AbOmpA účinně obnovuje schopnost .

Pronikání malých molekulární antibiotika prostřednictvím AbOmpA

Porins jsou pouze β-barel proteiny, které byly nalezeny ve vnější membráně GNB. AbOmpA je nejhojnější porin spojený s rezistencí na léky, připojením epiteliálních buněk a tvorbou biofilmu . Smani a kol. první prokázala účinek AbOmpA na fenotyp multi-rezistentní A. baumannii, a zjistil, že vyčerpání genu OmpA snížil Mikrofony chloramfenikolu, aztreonam, a nalidixinová o 8, 8 a na 2,67 krát, resp. Tato data naznačují, že OmpA se mohou účastnit vytlačování antibakteriální sloučeniny z periplasmic regionu a pár s efluxní systémy ve vnitřní membráně . Transmembránový transport řízený poriny je důležitým způsobem pro dodávání živin a malé molekulární hydrofilní antibakteriální sloučeniny bakteriím . Ramkumar a kol. bylo zjištěno, že AbOmpA selektivně umožnila průchod malých molekulárních antibiotik (obr. 1e). Například ETX2514, širokospektrální inhibitor β-laktamázy, proniká AbOmpA a zvyšuje antibakteriální aktivitu sulbaktamu v závislosti na AbOmpA. V budoucnu, vyjasnění AbOmpA krystalové struktury odhalí vztah mezi předběžná struktura substrátu, protein porin a prostupování, které poskytují více informací pro návrh malého molekulárního substrátu .

Nařízení AbOmpA výraz

Mezi GNB, faktory ovlivňující OmpA výraz se většinou vyznačuje tím, Escherichia coli, jako jsou živiny, podmínky kultivace, bakterie, infekce a metabolické enzymy . Mechanismy regulace OmpA a. baumannii se však stále zkoumají. Ačkoli OmpA v GNB mají podobnou dvoudílnou strukturu, aminokyselinové sekvence umístěné na vnějším povrchu bakterií jsou různé mezi různými rody . Kromě toho, že se učíme ze studií E. coli, máme zkoumat vlastnosti OmpA V A. baumannii. V posledních letech se ukázalo, že AbOmpA je vnější membránový protein související se stresem, jehož exprese je ovlivněna vnitřním a vnějším prostředím bakterií . Během studia účinků teploty, sucha a deprivace živin na dlouhodobé přežití citlivého kmene ATCC19606 a klinických izolátů, Bravo Z et al. zjistil, že adhezi a tvorbu biofilmu související geny, OmpA, bfmR a csuAB byly všechny down-regulována v vyhladovělé buňky, což vede k problémům při tvorbě biofilmů a šíření A. baumannii v krvi . Hfq bílkovin, hostitele bakteriální faktor poprvé objevil v. E. coi, je nezbytný pro syntézu RNA z bakteriofágu Qb, , a nyní je považován za transkripční regulátor týkající se reakce na stres. Nedostatek Hfq zpomaluje růst buněk a zvyšuje buněčnou citlivost na stres prostředí. Úroveň exprese OmpA v kmeni mutantů HFQ je dramaticky nižší než u kmene divokého typu . Kromě toho existuje kauzální korelace mezi tvorbou biofilmu a expresí Abompy V A. baumannii při léčbě antibiotiky při subminimálních inhibičních koncentracích (MIC). Jošinori a kol. inkubovány ATCC19606 a klinických izolátů s 1/2 MIC polymyxinu B (PMB) a kolistin (CST) 24 h, respektive, a zjistil, že existuje pozitivní korelace mezi mRNA úrovni AbOmpA a počet buněk v biofilmu CST léčených ATCC19606 napětí. Stejné výsledky byly pozorovány u R3 klinických izolátů v přítomnosti PMB . Meropenem při koncentraci 64 µg/mL a 128 µg/mL zvýšená AbOmpA výraz 1.81 a 1,63 záhyby, v tomto pořadí .

celkově existují tři faktory, které se v nedávných studiích podílely hlavně na regulaci přípravku AbOmpA. Za prvé, znevýhodněného prostředí, jako jsou hladovění, klesá produkce AbOmpA, takže je obtížné pro A. baumannii tvořit biofilm a dodržovat hostitelských buněk; za Druhé, Hfq, transkripční regulátor, jehož úroveň exprese je úzce souvisí s, že AbOmpA; a Konečně, některá antibiotika na sub-MIC podporovat AbOmpA projevu a tvorbu biofilmu. Ačkoli bylo prokázáno několik faktorů spojených s exprezií OmpA U a. baumannii, základní mechanismy je třeba prozkoumat.

terapeutické strategie zaměřené na Abompa

polypeptid

v současné době je syntetický malý polypeptid, který se specificky váže na OmpA, navržen tak, aby zabránil kontaktu a.baumannii s hostitelskými buňkami. AOA-2, cyklického hexapeptidu jako blokování agent AbOmpA bez baktericidní aktivita snižuje přilnavost A. baumannii, Pseudomonas aeruginosa a E. coli na povrchu biotických a abiotických a výrazně zvyšuje senzitivitu A. baumannii CST při koncentraci 125 µg/ml. In vivo, intraperitoneální injekce AOA-2 (10 mg/kg) v kombinaci s CST (10 mg/kg) zlepšila míra přežití myší s bakteriemií o 20% . Kromě toho byly postupně objeveny některé klasické antimikrobiální peptidy (zesilovače) interagující s AbOmpA, což je řada endogenních obranných peptidů, které zabíjejí bakterie a houby . Například bovinní myeloidní antimikrobiální peptid (BMAP-28) a jeho analogové peptidy zabíjely MDR-a.baumannii interakcí s AbOmpA. Tyto sloučeniny začaly ničit a. baumannii v koncentraci 40 µg / mL během pouhých 15 minut a po 30 minutách byly bakteriální buňky zjevně poškozeny unikající cytoplazmou . Kromě toho, LL-37 ve styku s aminokyselinových zbytků 74-84 z AbOmpA v dávce závislým způsobem snižuje přilnavost A. baumannii do hostitelských buněk. Tento inhibiční účinek LL-37 na adhezi byl však po deleci Abompy značně snížen . Lidský defensing-5 (HD5) je endogenní peptid, který zabíjí MDR-a. baumannii. Za účelem zvýšení antibakteriální aktivity HD5, non-kationtové a non-hydrofobní zbytky byly nahrazeny pozitivně nabitý arginin k získání derivátu jménem HD5d5, který by mohl silně vázat na AbOmpA a pak působí její toxin neutralizační funkci . Ačkoli existují důkazy, že MDR-Staphylococcus aureus jsou rezistentní na LL-37 produkcí katabolických enzymů, zda by a. baumannii mohl vyvinout rezistenci na přírodní zesilovače, nebylo hlášeno. Syntetické malých peptidů, konkrétně cílení AbOmpA bez baktericidní aktivitu, může se zabránilo spuštění bakteriální evoluce tlak a může být použit samostatně nebo v kombinaci s jinými antibakteriálními sloučeniny vyvíjet synergické efekty.

vakcína

jako ideální antigen vakcíny je abompa konzervována mezi různými klinickými kmeny s genomem, který se liší od lidského genomu . Luo G et al. bylo zjištěno, že imunizace myší 3 µg rOmpA v 0,1% hydroxidu hlinitého (Al (OH) 3) významně zlepšila míru přežití diabetických zvířat infikovaných a. baumannii HUMC1 o 40% a snížil počet bakteriálních kolonií všech orgánů (kromě plic) desetkrát ve srovnání s kontrolou. Kromě toho byla IgG protilátka proti rOmpA v séru také dramaticky zvýšena . Badmasti F et al. ukázala, že míra přežití myší s roztroušenou sepse vyvolané ATCC19606 byl pozoruhodně lepší (70%), po léčbě rekombinantním zachovány immunodominant regionu AbOmpA (8-346aa), a kromě toho, v kombinaci s Bap(1-487aa) také zvýšila míra přežití (> 80%) myší infikovaných MDR AB-44 . Kromě toho byly některé deriváty Abompy s vyšší antigenitou a nižší toxicitou navrženy bioinformatickými a imunoinformatickými nástroji. Například, román imunogenní model s 12 pramenů byla získána modifikací sekvencí aminokyselin na OmpA, ve kterém K320 a K322 byly nahrazeny Alaninem, „NADEEFWN“ byl nahrazen „YKYDFDGVNRGTRGTSEEGTL“, „VVQPGQEAAAPAAAQ“ se nachází na C-terminální a pozici 1-24 z N – terminální byly odstraněny. Tento AbOmpA-odvozené antigen byl schopen spuštění tvorby protilátek, které zabíjí bakterie Pseudomonas aeruginosa a a. baumannii . Dalším způsobem je vývoj DNA vakcíny, která přitahuje více pozornosti díky účinnosti a trvanlivosti. DNA vakcína je značně bezpečná a snesitelná, protože během výroby neobsahuje oslabené nebo mrtvé patogeny . Hossein et al. klonované AbOmpA genu a vložení do eukaryotické expresní vektor pBudCE4.1 získat rekombinantní pBudCE4.1–ompA. Po transfekci tímto rekombinantním plasmidem lidské dermální fibroblastové buňky (HDF) účinně exprimovaly Abompu . Dále hodnotili imunogenní potenciál pBudCE4. 1-ompA u myších modelů. Po imunizaci touto vakcínou se IL-2, IL-4, IL-12, IgM, IgG a INF-γ dramaticky zvýšily v séru a ve srovnání s kontrolní skupinou přežilo více zvířat . Neměli bychom však ignorovat onkogenní potenciál rekombinantních molekul kvůli jeho náhodné integraci do hostitelského genomu.

monoklonální protilátky (mAbs)

obecně se uznává, že protilátky mohou být použity k obraně proti mikrobiálním infekcím. Pasivní imunizace indukované protilátky zaměřené AbOmpA používá k být považován za potenciální terapeutické metody pro MDR a XDR-A. baumannii infekcí . Léčba polyklonálními Anti-OmpA Séry však vykazovala mnoho nevyhnutelných nedostatků, jako je přecitlivělost na imunitní komplex, nízký obsah specifických protilátek a potenciální nebezpečí šíření infekčních onemocnění . Nedávno technologie monoklonálních protilátek (mAb) přispívá k rozvoji antibakteriálních Mab. Ve srovnání s polyklonálními Anti-OmpA Séry mají Mab více výhod, jako je vyšší bezpečnost, lepší homologie a konkrétnější cíle . Mabs cílení OmpA podporuje makrofágy zabít a. baumannii 307.30 (AB307.30), s výjimkou těch, které jsou pokryty hustou tobolkou, zejména XDR-a.baumannii. Důkazy ukázaly, že vazba mAbs na klinické izoláty byla mnohem slabší než vazba mezi mABs a ATCC19606. Zda kapsle přes buněčnou stěnu zabraňuje vazbě mAbs na XDR-a. baumannii? Mutantní kmen negativní na tobolky K1 (AB307.30) silně kombinovaný s anti-OmpA mAbs, což naznačuje, že polysacharidy tobolek mohou chránit vazebná místa OmpA . Špatnou kombinaci mezi mAbs a XDR-a. baumannii je třeba dále vyřešit a mAbs lze také použít pro jiné konzervované epitopy a. baumannii.