det eskalerende tempo, hvormed genomsekventeringsprojekter er afsluttet, har øget behovet for metoder med høj kapacitet til kontrol af genekspression. En mulig tilgang er brugen af antisense oligonukleotider til at binde mRNA og forhindre proteinsyntese. I teorien tillader denne strategi hurtige fremskridt fra syntese af oligomerer til observation af fænotype . I praksis har antisense-teknologi været plaget af en tilbøjelighed til uspecifikke interaktioner, og disse har bremset dens brede anvendelse på biologiske undersøgelser . For nylig har forbedringer i oligonukleotiders kemiske egenskaber og i vores forståelse af deres virkningsmekanisme imidlertid kombineret for at gøre deres vellykkede anvendelse mere sandsynlig. Arbejde fra en række laboratorier antyder nu , at morpolinooligonukleotider kan mikroinjekteres i sebrafisk , søpindsvin eller Fremmedhadsembryoner, hvor de blokerer genekspression og producerer fænotypiske effekter i de tidlige udviklingsstadier.

Morpolino oligonukleotider er ikke-ioniske DNA-analoger tilgængelige fra Gene Tools LLC . De har ændrede rygradsforbindelser sammenlignet med DNA eller RNA (figur (Figur1).1). På trods af deres ændrede rygrad binder morpholinos sig til komplementære nukleinsyresekvenser ved hjælp af baseparring. Denne binding er ikke strammere end binding af analoge DNA-og RNA-oligomerer, hvilket nødvendiggør brugen af relativt lange 25-base morpholinos til antisense-geninhibering. Rygraden gør morpholinos resistente over for fordøjelse af nukleaser. Også fordi rygraden mangler negativ ladning, menes det, at morpholinos er mindre tilbøjelige til at interagere ikke-selektivt med cellulære proteiner; sådanne interaktioner skjuler ofte observationen af informative fænotyper. Styrken af morpholinos som værktøjer til undersøgelse af hvirveldyrsudvikling er godt beskrevet i en nylig gennemgang af Ekker . Deres største fordel er, at fænotyper hurtigt kan observeres hos F0-dyr ved hjælp af en relativt billig metode.

strukturer af DNA og morpolinooligonukleotider. R og R’ betegner fortsættelse af oligomerkæden i henholdsvis 5′ eller 3′ retning.

en stor hindring for brugen af antisense oligonukleotider er at vælge en målsekvens. Antisense oligonukleotider, der indeholder DNA, er i stand til at danne RNA-DNA-hybrider. Disse hybrider kan fungere som et substrat for RNase H, hvilket fremmer spaltning af mRNA-målet. Fordi RNA nedbrydes, har enhver sekvens inden for det kodende område af målgenet potentialet til at være et nyttigt antisense-sted. Morpholinos danner derimod RNA-morpholino-hybrider, der ikke er substrater for RNase H, og mRNA ‘ et nedbrydes således ikke. Dette er en vigtig overvejelse, fordi morpholinos målrettet mod det meste af det kodende område vil blive fortrængt af ribosomet, da det translokeres langs mRNA ‘ et og derfor vil være ineffektivt til at forhindre oversættelse. Morpolinooligonukleotider målrettet mod 5 ‘ – ikke-oversat region (UTR) eller startkodonet fungerer muligvis fortrinsvis ved at forhindre oversættelsesmaskineriet i at binde sig, men der er ingen garanti for, at dette er en generel regel, og det skal demonstreres empirisk for hvert målgen.Ekker og kolleger rapporterer, at fluorescerende mærkede morpolinooligonukleotider kan injiceres i kugle-fase sebrafisk embryoner og opnå ensartet fordeling. Morpolino-oligomerer målrettet mod startkodonet for grønt fluorescerende protein (GFP) blokerede GFP-ekspression, mens kontrololigomerer, der er komplementære til GFP, ikke gjorde det. Niveauet af GFP mRNA blev ikke ændret, hvilket er som forventet, hvis RNase H ikke er involveret. Disse modeleksperimenter er signifikante, fordi de etablerer morpolinooligomers evne til utvetydigt at blokere genekspression på en sekvensspecifik måde. Ekker og kolleger rapporterer også hæmning af flere endogene sebrafiskgener og er begyndt at udarbejde en database, der beskriver fænotyperne produceret af morpolinooligonukleotider .

veje undersøgt af Ekker og kolleger, der bruger morpholinos, inkluderer udviklingssignalering gennem Sonic hedgehog ligand og effekten af VEGF-A angiogen vækstfaktorgenekspression på angiogenese. Samlet set har Ekker-laboratoriet observeret interessante fænotyper i 16 ud af de 17 målrettede gener . Hammerschmidt og kolleger har undersøgt morpholinos målrettet mod type i serin/threonin kinase receptor gen Alk8 / Lost-a-fin. Lin og kolleger har rapporteret, at hæmning med morpholinos af Fes, som koder for et sinc-fingerprotein, kan reducere ekspression af dlh2, som koder for et homeodomainholdigt protein, i den ventrale forhjerne. Hvor ekspressionsniveauer blev undersøgt, blev der opnået signifikante ‘nedslag’ af genekspression (op til 90%).

i andre organismer end sebrafisk har Angerer og kolleger brugt morpholinos designet til at blokere oversættelsen af SpKr1, et transkriptionsfaktormål for regulering af Kurt-catenin, i søpindsvin embryoner . Som med arbejdet af Nasevicius et al. , en ‘slå ned’ af GFP-udtryk blev brugt som en positiv kontrol, og introduktion af 4 lyrm anti-SpKr1 morpolino resulterede i, at endoderm ikke kunne differentiere. Heasman et al. har studeret signalering af ksenopus . Injektion ved 2-eller 4-celletrin blokerer dannelse af dorsalakse, mens injektion ved 8-celletrin blokerer hoveddannelse . Endelig har Erickson og kolleger brugt elektroporation til at levere morfolinos rettet mod Ræv3 til kyllingembryoner. Rævd3 er en transkriptionsfaktor i vingespiral – klasse, og introduktion af morpholiner ændrer fremskridt i neurale crest-celler, et resultat, der er i overensstemmelse med lokaliseringen af Rævd3 . Disse eksperimenter illustrerer potentialet for morpholinos til fint at dissekere den tidsmæssige udvikling af udviklingen. Når man blokerer et gen med ukendt funktion eller når man observerer et uventet resultat, er det dog vigtigt at huske på, at den nye fænotype ikke nødvendigvis skyldes reduktion af ekspression af målgenet. Denne advarsel er også til stede for standard genetiske knockouts og indebærer simpelthen, at resultaterne skal fortolkes forsigtigt.

disse data er provokerende og antyder, at morpolino antisense-oligomerer i det mindste i disse dyremodeller kan blive rutinemæssige værktøjer til generering af mutante fænotyper. Det er dog vigtigt at indse, at antisense-teknologi sjældent, hvis nogensinde, duplikerer komplette ‘tab af funktion’ mutationer. Vi advarer også om, at antisense-reagenser tidligere er blevet misbrugt i vid udstrækning. Kontroller har manglet, resultater er ofte marginale, og observerede fænotyper har ofte vist sig at skyldes en lang række uventede ikke-antisense mekanismer. Årsagerne til disse ikke-antisense virkninger inkluderer utilsigtede interaktioner med proteiner og binding til ikke-mål nukleinsyresekvenser . Det er derfor bydende nødvendigt, at metoden anvendes omhyggeligt for at undgå at gentage de tidligere fejl, der har bremset udviklingen af antisense-teknologi.

som med ethvert antisense-eksperiment er strenge kontroller for ikke-specifikke effekter kritiske for at fortolke fænotyper korrekt. Eksperimenter, der bruger morpolinooligonukleotider, skal altid teste mindst en uoverensstemmelse og en krypteret kontrololigomer, og resultaterne af disse tests skal rapporteres. Dosis-respons-analyser til bestemmelse af margenen mellem induktion af en specifik fænotype og begyndelsen af toksicitet er også vigtige. For eksempel kan denne margen være mindre end dobbelt, hvilket understreger behovet for omhyggeligt kontrolleret dosisbestemmelse og præcist kvantificeret levering. Når det er muligt, skal niveauerne af både målproteinet og et eller flere kontrolproteiner evalueres i prøver behandlet med eksperimentelle og kontrolmorfolinos. Derudover foreslår Ekker, at resultaterne bekræftes gennem mRNA-redning og/eller ved sammenligning med fænotyper af eksisterende mutanter .

den høje succesrate for inhibering af genekspression af morpolinooligonukleotider er overraskende. Dogmet i antisense-feltet er, at målretning mod ATG-startstedet ikke er en bestemt opskrift på succes, og at så mange som 40 oligonukleotider muligvis skal testes for at identificere en, der effektivt hæmmer genekspression . Hvis målretning af startkodonet fungerer så godt, hvorfor gør flere efterforskere ikke dette i stedet for at ty til detaljerede skærme? Morpholinos kan være mere effektive end andre antisense-kemikalier, men hvorfor? Sidstnævnte spørgsmål skal løses ved systematisk undersøgelse af deres egenskaber og sammenligning med andre typer oligonukleotid. Den dramatisk ændrede morpolino rygrad kan måske binde til mRNA mere effektivt eller fungere som en bedre blok til oversættelse. I så fald kunne morpholinos være overlegne midler til genhæmning i forhold til andre typer oligomer, der kan blokere translation, såsom låst nukleinsyre (LNA), peptidnukleinsyre (PNA) eller 2′-modificeret RNA . På den anden side kan andre typer oligomer fungere så godt som eller bedre end morfolinos, men deres potentiale kan være mindre tydeligt, fordi de ikke er blevet testet i gunstige eksperimentelle systemer.vildledende observationer som følge af uspecifikke interaktioner har forvirret meget tidligere forskning ved hjælp af oligonukleotider . Disse vanskeligheder har fået mange forskere til at være skeptiske over for brugen af oligonukleotider som et redskab til grundforskning. Arbejde offentliggjort i løbet af de sidste 18 måneder antyder imidlertid, at morpolino-oligomerer kan have egenskaber, der gør det muligt for forskere rutinemæssigt at generere lærerige fænotyper. Resultaterne er spændende med den implikation, at morpolino-oligomerer kunne give et generelt anvendeligt værktøj til kemisk genetik og funktionel genomik. For at realisere dette potentiale skal de egenskaber, der styrer effektiviteten af disse reagenser, bestemmes. Disse oplysninger vil gøre det muligt for forskere at optimere metoden og opnå maksimal ‘slå ned’ af et givet mål, samtidig med at de minimerer forvirrende, uspecifikke effekter. Brugere af morpolino-oligomerer skal forstå de problemer, der tidligere har plaget antisense-feltet, lære af disse tilbageslag og udføre passende kontroleksperimenter. Disse kontroleksperimenter, mindst lige så meget som produktionen af interessante fænotyper, vil afgøre, om morpolinooligonukleotider er det gennembrud, som nyere forskning antyder.