Acinetobacter baumannii (A. baumannii) forårsager hospitalserhvervede infektioner (HAI), såsom ventilatorassocieret lungebetændelse, bakteriæmi, urinvejsinfektioner, meningitis og kirurgiske sårinfektioner, hvilket fører til en stigende dødelighed hos patienter. Risikofaktorer for disse infektioner omfatter mekanisk ventilation, brug af bredspektret antibiotika, ICU opholdstid og koma . Statistisk set blev omkring 1.000.000 mennesker globalt inficeret med A. baumannii hvert år, og halvdelen af disse infektioner var forårsaget af multidrugresistente (MDR) stammer . Dødeligheden af A. baumannii-infektion i ICU var 45~60% og nåede endda 84,3%, når patienter blev inficeret med omfattende lægemiddelresistens A. baumannii . I 2017 blev carbapenem-resistent A. baumannii (krabbe) rangerede først med hensyn til trusler mod menneskers sundhed og haster med at udvikle relevante antibiotika, ifølge den lægemiddelresistente bakterieliste frigivet af hvem .

colistin (CST) og tegacyclin, de mest almindeligt anvendte antibiotika mod carbapenemase-producerende GNB, er imidlertid blevet ineffektive på grund af antibiotikaresistens . For at opnå klinisk effektivitet måtte lægerne øge dosis af CST og kombinere den med tegacyclin . Desværre for bakteriæmi og alvorlige luftvejsinfektioner forårsaget af krabbe og KSDR-A. henholdsvis baumannii fungerede kombinationsterapi stadig ikke effektivt . Overfor den alvorlige bakterieresistens har forskere indset, at det haster med at udvikle nye antibakterielle strategier snarere end at stole på traditionelle antibiotika.

generelt er der to måder at designe nye antimikrobielle midler på. Den ene er at hæmme produktionen af essentielt stof til bakterieoverlevelse ; den anden er at hæmme virulensfaktorer eller antibiotikaresistensgener af patogene bakterier for at undertrykke patogenicitet eller forbedre deres følsomhed over for antibiotika . Imidlertid medfører hæmning af en enkelt væsentlig komponent uundgåeligt et stort evolutionært pres på bakterier og fremmer udviklingen af lægemiddelresistente stammer på højt niveau . Derfor er den nye interventionsstrategi rettet mod ikke-enssentielle processer nøglen til at overvinde bakteriel resistens . For eksempel blokerer hæmning af Abai/AbaR kvorumsensorsystemer med naturligt eller syntetisk inhibitormiddel kommunikationen mellem bakterier og hæmmer biofilms dannelse . Som en klasse af vigtige virulensfaktorer i bakterier har ydre membranproteiner (OMP ‘ er) tiltrukket meget mere opmærksomhed.

OMP ‘ er er en klasse af unikke integrerede membranproteiner, der er forankret i om, hvis prisT-tøndestrukturer blev dannet af 8 til 26 tråde. Der er store, forlængede sløjfer mellem trådene på den ekstracellulære side og korte sløjfer på den periplasmiske side. Disse egenskaber giver OMPs høj stabilitet i membran og evne til at kæmpe mod ekstremt barske miljøer . Selvom forskellige OMP ‘ er har forskellige sekvenser og funktioner, deler de lignende struktur og biologiske egenskaber . Omp ‘ er af bakterier består af lige antal tråde, og vigtigst af alt afhænger funktions-og stativforskydningsnummeret af deres sekvenser. Som virulensrelaterede proteiner har komplementbindende protein i E. coli og fibronectin-og heparinbindende protein Ail i Yersinia pestis en sammenlignelig lignende struktur, men deres sekvensidentitet var lavere end 45%. Mangfoldigheden af OMPs-sekvens forekommer ved N-terminal væsentligt mere end C-terminal, og det konserverede forstærkningssignal styrer foldning og korrekt samling af omps .

indtil nu er typerne af OMP ‘ er i A. baumannii imidlertid ikke blevet identificeret klart, og kun få spredte rapporter var tilgængelige, hovedsageligt inklusive BamA, LptD, Omp33–36, Ompv. CarO og OprD. BamA selv som en OMP automatisk kan indsætte i OM og er ansvarlig for samlingen af andre OMPs ; LptD medierer transporten af LPS til den ydre membran (OM), hvis tab kan forårsage akkumulering af mellemprodukter og fejlplacering af LPS og til sidst føre til forstyrrelse af bakteriel membranintegritet ; Omp33–36 er en kanal til passage af vand, som kan inducere apoptose af værtsceller ved at aktivere caspase og regulere autofagi ; Ompv er en slags hydrofob porin, der findes i OM og cytoplasma, og spiller en vigtig rolle i modulering af homeostase af jernion i bakterier ; CarO og OprD er relateret til resistens af carbapenem .

blandt de OMP ‘ er af A. baumannii, OmpA er den mest dybt studerede virulensfaktor, der spiller nøgleroller i reguleringen af adhæsion, aggressivitet og biofilmdannelse af A. baumannii og immunrespons af vært. Overproduktion af OmpA er en uafhængig risikofaktor for dødeligheden af nosokomial lungebetændelse og bakteriæmi forårsaget af A. baumannii . Desuden kan ekspressionsniveauet for OmpA målt ved KVRT-PCR bruges som et hurtigt diagnostisk indeks for antibiotikaresistent A. baumannii, hvorved resultaterne er meget konsistente med dem gennem traditionel MIC-analyse .

denne gennemgang overviste Abompas struktur, funktion og patogenese, opsummerede terapeutiske strategier rettet mod AbOmpA og fremhævede, hvorfor AbOmpA er et potentielt mål for behandling af A. baumannii.

OmpA struktur og funktion

OmpA blev først identificeret som et varmemodificerbart protein i Escherichia coli (E. coli) i 1974 og oprindeligt oprenset i 1977. Dens molekylmasse varierer fra 28 kDa til 36 kDa . OmpA-familien er en gruppe af overfladeeksponerede porinproteiner med højt kopiantal i OMP ‘ er af GNB. N-terminaldomæne af OmpA er en antiparallel LARP-tønde struktur bestående af otte transmembranstrenge for at blive indlejret i den ydre membran. De otte tråde er forbundet med fire lange sløjfer på overfladen af den ydre membran og tre korte drejninger i periplasmisk domæne, der danner kugleformet C-terminal . Selv i en specifik bakteriestamme er aminosyresekvenserne af OmpA forskellige blandt flere underklasser .

i de senere år har forskere fundet, at aminosyrerne af AbOmpA fra en række kliniske isolater er stærkt konserverede (> 89%), mens de ikke er homologe med humant proteom . Ved at sammenligne forskellige OmpA – lignende proteiner blev de to konservative aminosyrer, R286 og Asp271, som er placeret i C-terminal domæne af OmpA, identificeret. Begge aminosyrer binder ikke-kovalent til diaminopimelat aminosyre (DAP), en komponent af peptidoglycan (PGN) . Denne interaktion antyder, at OmpA spiller en nøglerolle i opretholdelsen af bakteriel overfladeintegritet. Generelt stabiliserer OmpA i GNB-arter deres struktur ved selvdimerisering, hvilket forhindrer, at bøjningsforbindelserne mellem karret-tøndestruktur og periplasmisk lyseres .

AbOmpA er afgørende for A. baumannii at klæbe til og invadere epitelceller

A. baumannii er i stand til at komme ind og fortsætte inde i værtsceller. For det første klæber den sig til værtsceller, invaderer og translokerer derefter til kernen. Efter at have dræbt værtsceller spredes det i blodbanen og væv . AbOmpA formidler adhæsionen og invasionen af A. baumannii til epitelceller (Fig. 1A, øverste panel). Sammenlignet med vilde bakterier er den isogene abompa-mutante stamme vanskeligere at invadere værtsceller. Præinkubation med rekombinant AbOmpA (rAbOmpA) hæmmer dramatisk adhæsion og invasion af stærkt invasiv A. baumannii 05ka103 til epitelceller. Og in vivo forsinkes patogenesen af mutationen af AbOmpA, da bevis viste, at mindre bakteriel byrde i blod af en Murin lungebetændelsesmodel . Til vedhæftningsmekanismen for OmpA, Smani et al. fandt, at det var lettere for A. baumannii at fastgøre 96-brøndspladerne belagt med fibronektion end den, der var belagt med BSA, og de identificerede proteinbindingen med fibronektion var OmpA, hvilket indikerer, at bindingen af OmpA til firbronectin var det første trin i interaktionen mellem A. baumannii med værtsceller.

funktioner af OmpA i A. baumannii. et øverste panel. Ved kontakt med epithelceller hemmeligheder bakterier OmpA ind i disse celler. OmpA er i stand til at translokere i kerne og mitokondrier og stimulere mitokondrier til at frigive cytokrom c. derefter fremmer cytokrom c apoptoseinducerende faktor (AIF) til at translokere til kerne og forårsager til sidst apoptose af epitelceller. Nederste panel. OmpA øger produktionen af nitratoksidsyntase (iNOS) og overfladeekspression af Toll-lignende receptor 2 (TLR2) i epitelceller, som begge udløser værtscelledød. b ved lav koncentration aktiverer OmpA DCs, som derefter stimulerer CD4 + T-celler til at udøve Th1-respons, mens de er ved høj koncentration; OmpA dræber DC ‘ er ved at inducere mitokondrier til at frigive ROS. c AbOmpA kan arrestere serumfaktor H i serum, hvilket forårsager lammelse af komplementrespons. d AbOmpA spiller en dominerende rolle ved fastgørelse af abiotiske overflader og dannelse af biofilmmatrice. e AbOmpA er et porinprotein, der lokaliseres i den ydre membran, hvilket selektivt tillader gennemtrængning af små molekylære forbindelser

AbOmpA kan direkte forårsage værtsceller død, hvis de leveres til værtsceller via ydre membranvesikler (OMV ‘ er) . Som vist i Fig. 1a, efter indtastning af værtsceller, kan AbOmpA lokaliseres til mitokondrier, hvilket fører til frigivelse af molekyler (såsom cytochrom C, apoptose-inducerende faktor (AIF)) i det tidlige stadium af A. baumannii-infektion, AIF nedbryder kromosom-DNA og letter apoptose af epitelceller . Derudover kan OmpA også translokeres til kerne af værtsceller afhængigt af dets monopartite nukleare lokaliseringssignal (NLS)-“KTKEGRAMNRR”, som ligger mellem rester 320 og 330 af OmpA. Denne subcellulære målretning af rAbOmpA kan inducere apoptose af værtsceller, men den specifikke underliggende mekanisme er ikke klar . rAbOmpA oprenset fra A. baumannii ATCC19606 i en koncentration på 6 liter / mL er tilstrækkelig til at udøve cytotoksicitet over for humane laryngeale epitheliale HEp-2-celler . AbOmpA fremmer A. baumannii at klæbe til og invadere værtsceller, hvilket fører til deres død ved at lokalisere i mitokondrier og kerne, men om AbOmpA fungerer i andre organeller, skal det stadig undersøges.

AbOmpA stimulerer medfødt immunrespons

AbOmpA påvirker også værtsimmunsystemet. Selvom AbOmpA-behandling ikke påvirker ekspressionsniveauet for proinflammatoriske cytokiner eller kemokin, øger det produktionen af salpetersyresyntase (iNOS) og overfladeekspression af Toll-lignende receptor 2 (TLR2) i HEp-2-celler (Fig. 1A, nederste panel). Begge af dem er vigtige i vært-forsvarsmekanisme. I lungeinfektion udøver bakteriostatiske og baktericide funktioner, og denne iltningsspænding giver en anden årsagsfaktor til celledød. Og TLR ‘er genkender patogenassocierede molekylære mønstre (Pamp’ er) og udløser immunrespons . Virkningerne af AbOmpA på knoglemarvsafledte dendritiske celler (DCs) er illustreret i Fig. 1b. AbOmpA i en koncentration på 200 ng/mL aktiverer DCs via TLR2 -, MAPK-og NF-kB-vej, hvilket stimulerer CD4+T-celler mod et Th1-respons . Imidlertid har AbOmpA en tendens til at dræbe DC ‘ er i høje koncentrationer (Karr 3 Karr/mL) ved at øge de reaktive iltarter (ROS) fra mitokondrier . Vaccination med rAbOmpA kunne inducere type 2-immunrespons hos mus, hvilket beskadigede balancen mellem IL-4 og INF-c og førte til forekomsten af infektion . Derudover lammede AbOmpA komplementresponssystemet ved at arrestere serumfaktor H (Fig. 1c).

AbOmpA inducerer dannelse af biofilm

Biofilm gør det muligt for A. baumannii at overleve under fjendtlige forhold , hovedsageligt bestående af protein, ekstracellulært DNA og polysaccharider. Ifølge statistikkerne fra National Institutes of Health og Center for Disease and Prevention blev 65-80% humane infektioner forårsaget af biofilmdannende bakterier . Baseret på de multifunktionelle egenskaber ved biofilmdannelse blev der identificeret en række gener forbundet med bakteriel adhæsion og biofilmdannelse, såsom AbOmpA, beta-lactamase PER-1 (blaPER-1) og biofilm-associeret protein (Bap) . Faktisk spiller OmpA af A. baumannii atcc19606 en dominerende rolle i dannelsen af stabil biofilm på plastoverfladen (Fig. 1d). AbOmpA mutant stammer undlader at danne biofilm, mens genopfyldning af AbOmpA allel effektivt genopretter evnen .

gennemtrængning af små molekylære antibiotika gennem AbOmpA

Poriner er kun larr-tønde proteiner, der er fundet i den ydre membran af GNB. AbOmpA er den mest rigelige porin forbundet med lægemiddelresistens, epitelceller vedhæftning og dannelse af biofilm . Smani et al. AbOmpA på fænotypen af multiresistent A. baumannii og fandt, at udtømningen af OmpA-genet reducerede mikrofonerne af chloramphenicol, atreonam og nalidici med henholdsvis 8, 8 og 2,67 gange. Disse data antydede, at OmpA kan deltage i ekstrudering af antibakteriel forbindelse fra periplasmisk region og par med udstrømningssystemer i indre membran . Transmembrantransporten kontrolleret af poriner er en vigtig måde at levere næringsstoffer og lille molekylær hydrofil antibakteriel forbindelse til bakterier . Ramkumar et al. fandt, at AbOmpA selektivt tillod passage af små molekylære antibiotika (Fig. 1e). F. eks.trænger etks2514, den bredspektrede Kurt-lactamasehæmmer, gennem AbOmpA og forøger sulbactams antibakterielle aktivitet på en abompa-afhængig måde. I fremtiden vil afklarende abompa krystalstruktur afsløre forholdet mellem foreløbig struktur af substrat, porinprotein og permeation, hvilket giver mere information til design af lille molekylært substrat .

regulering af abompa-ekspression

blandt GNB er de faktorer, der påvirker ompa-ekspression, for det meste karakteriseret ved Escherichia coli, såsom næringsstoffer, kulturbetingelser, bakteriofaginfektion og metaboliske symptomer . Imidlertid undersøges OmpA-reguleringsmekanismerne for A. baumannii stadig. Selvom OmpA i GNB har en lignende todelt struktur, aminosyresekvenser placeret på den ydre overflade af bakterier er forskellige blandt forskellige slægter . Udover at lære af undersøgelserne af E. coli, skal vi undersøge karakteristika ved OmpA i A. baumannii. I de senere år har det vist sig, at AbOmpA er et stressrelateret ydre membranprotein, hvis ekspression påvirkes af bakteriens indre og ydre miljø . Under undersøgelsen af virkningerne af temperatur, tørhed og næringsstofmangel på den langsigtede overlevelse af følsom stamme ATCC19606 og kliniske isolater, Bravo et al. fundet, at adhæsions-og biofilmdannelsesrelaterede gener, OmpA, bfmR og csuAB alle var nedreguleret i sultede celler, hvilket førte til vanskeligheder med at danne biofilm og spredning af A. baumannii i blod . Protein, en værtsbakteriefaktor, der først blev opdaget i E. coi, er uundværlig for RNA-syntese af bakteriofag KB,, og nu betragtes det som en transkriptionel regulator relateret til stressresponser. HCV-mangel forsinker cellevækst og øger cellulær følsomhed over for miljø stress. Ekspressionsniveauet for OmpA i HFK-mutantstamme er dramatisk lavere end i en vildtypestamme . Derudover er der en årsagssammenhæng mellem dannelse af biofilm og abompa-ekspression i A. baumannii under behandling af antibiotika ved subminimum inhiberende koncentrationer (MIC). Yoshinori et al. atcc19606 og kliniske isolater med 1/2 MIC polymyksin B (PMB) og colistin (CST) i henholdsvis 24 timer og fandt, at der var en positiv korrelation mellem mRNA-niveauet af AbOmpA og antallet af biofilmceller i cst-behandlet atcc19606-stamme. De samme resultater blev observeret i R3 kliniske isolater i nærvær af PMB . Meropenem i en koncentration på 64 liter/mL og 128 liter/mL øgede abompa-ekspression med henholdsvis 1,81 og 1,63 folder .

samlet set er der tre faktorer, der hovedsageligt er involveret i reguleringen af AbOmpA i nylige undersøgelser. For det første mindsker dårligt stillede miljøer såsom sult produktionen af AbOmpA, hvilket gør det vanskeligt for A. baumannii at danne biofilm og klæbe til værtsceller; for det andet HFK, en transkriptionel regulator, hvis ekspressionsniveau er tæt knyttet til Abompas; endelig fremmer nogle antibiotika ved sub-MIC AbOmpA-ekspression og dannelse af biofilm. Selv om flere faktorer er blevet bevist forbundet med ompa-ekspression i A. baumannii, er de underliggende mekanismer fortsat at blive undersøgt.

terapeutiske strategier rettet mod AbOmpA

polypeptid

I dag er det syntetiske lille polypeptid, der specifikt binder til OmpA, designet til at forhindre A. baumannii i at kontakte værtsceller. AOA-2, et cyklisk geksapeptid som et blokerende middel til AbOmpA uden bakteriedræbende aktivitet nedsætter adhæsionen af A. baumannii, Pseudomonas aeruginosa og E. coli til overfladerne af biotisk og abiotisk og forbedrer signifikant følsomheden af A. baumannii til CST i koncentrationen på 125 liter/mL. In vivo forbedrede den intraperitoneale injektion af AOA-2 (10 mg/kg) i kombination med CST (10 mg/kg) overlevelsesraten for mus med bakteriæmi med 20% . Derudover er nogle klassiske antimikrobielle peptider (ampere), der interagerer med AbOmpA, gradvist blevet opdaget, som er en række endogene forsvarspeptider til at dræbe bakterier og svampe . For eksempel dræbte bovint myeloid antimikrobielt peptid (BMAP-28) og dets analoge peptider mdr-A. baumannii ved at interagere med AbOmpA. Disse forbindelser begyndte at ødelægge A. baumannii i en koncentration på 40 liter / mL inden for kun 15 minutter, og efter 30 minutter blev bakteriecellerne åbenbart beskadiget med lækkende cytoplasma . Derudover interagerede LL-37 med aminosyreresterne 74-84 af AbOmpA på en dosisafhængig måde, hvilket reducerede adhæsionen af A. baumannii til værtsceller. Imidlertid blev denne hæmmende virkning af LL-37 på adhæsion kraftigt reduceret efter AbOmpA-deletion . Human defensing – 5 (HD5) er et endogent peptid, der dræber MDR-A. baumannii. For at forbedre den antibakterielle aktivitet af HD5 blev ikke-kationiske og ikke-hydrofobe rester erstattet af positivt ladet arginin for at opnå et derivat ved navn HD5d5, som stærkt kunne binde til AbOmpA og derefter udøvede sin toksinneutraliserende funktion . Selvom der er tegn på , at mdr-Staphylococcus aureus er resistent over for LL-37 ved at producere kataboliske stoffer, er det ikke rapporteret, om A. baumannii kunne udvikle resistens over for naturlige forstærkere. Det syntetiske lille peptid, der specifikt er rettet mod AbOmpA uden bakteriedræbende aktivitet, kan undgå at udløse bakterieudviklingstryk og kunne bruges alene eller kombineret med andre antibakterielle forbindelser for at udøve synergistiske virkninger.

Vaccine

som et ideelt antigen af vaccine bevares AbOmpA blandt forskellige kliniske stammer med genomet, der adskiller sig fra humant genom . Luo G et al. fandt, at immunisering af mus med 3 larg rOmpA i 0,1% aluminium hydroksid (al (OH)3) signifikant forbedret overlevelsesraten for diabetiske dyr inficeret med A. baumannii HUMC1 med 40% og reducerede antallet af bakteriekolonier i alle organer (undtagen lunge) med ti gange sammenlignet med kontrol. Derudover blev IgG-antistoffet mod rOmpA i serum også dramatisk forbedret . Badmasti F et al. påvist, at overlevelsesraten for mus med dissemineret sepsis induceret af Atcc19606 var bemærkelsesværdigt forbedret (70%) efter behandling med rekombinant konserveret immunodominant region af AbOmpA (8-346aa), og derudover øgede kombinationen med Bap(1-487aa) også overlevelsesraten (> 80%) af mus inficeret med MDR AB-44 . Desuden blev nogle derivater af AbOmpA med højere antigenicitet og lavere toksicitet designet af bioinformatiske og immunoinformatiske værktøjer. For eksempel blev en ny immunogen model med 12 tråde opnået ved at modificere aminosyresekvenser af OmpA, hvor K320 og K322 blev substitueret med alanin, “NADEEFVUN” blev erstattet af “YKYDFDGVNRGTRGTSEEGTL”, “VVVVVNVNRGTRGTSEEGTL” placeret ved C-terminal og position 1-24 af N – terminal blev fjernet. Dette abompa-afledte antigen var i stand til at udløse produktionen af antistoffer, der dræber Pseudomonas aeruginosa og A. baumannii . En anden måde er at udvikle DNA-vaccine, som har tiltrukket mere opmærksomhed på grund af effektiviteten og holdbarheden. DNA-vaccine er betydeligt sikker og tolerabel, fordi den ikke indeholder svækket eller død patogen under produktionen . Hossein et al. klonet AbOmpA-gen og indsat det i en eukaryot ekspressionsvektor pBudCE4.1 for at opnå det rekombinante pBudCE4.1–ompA. Efter transfekteret med dette rekombinante plasmid udtrykte humane dermale fibroblastceller (HDF) effektivt AbOmpA . Dernæst evaluerede de det immunogene potentiale af pBudCE4.1-ompA i musemodel. Efter immunisering med denne vaccine steg IL-2, IL-4, IL-12, IgM, IgG og INF-Kurt alle dramatisk i serum, og flere dyr overlevede sammenlignet med kontrolgruppen . Vi bør dog ikke ignorere det onkogene potentiale af rekombinante molekyler på grund af dets tilfældige integration i værtsgenomet.

monoklonale antistoffer (mAbs)

det er almindeligt accepteret, at antistoffer kan bruges til forsvar mod mikrobielle infektioner. Passiv immunisering induceret af antistoffer rettet mod AbOmpA blev tidligere betragtet som en potentiel terapeutisk metode til mdr-og baumannii-infektioner . Imidlertid har behandling med polyklonal anti-OmpA sera vist mange uundgåelige mangler, såsom immunkompleks overfølsomhed, lavt indhold af specifikke antistoffer og den potentielle fare for spredning af infektionssygdomme . For nylig bidrager monoklonalt antistof (mAb) teknologi til udviklingen af antibakterielle MAB ‘ er. Sammenlignet med polyklonal Anti-OmpA sera har mAbs flere fordele, såsom højere sikkerhed, bedre homologi og mere specifikke mål . MAbs-målretningen OmpA fremmer makrofager til at dræbe A. baumannii 307.30 (AB307.30), undtagen dem, der er dækket med tyk kapsel, især KSDR-A. baumannii. Bevis viste, at bindingen af MAB ‘er til kliniske isolater var meget svagere end bindingen mellem MAB’ er og atcc19606. Om kapslen over cellevæggen forhindrer MAB ‘ er i at binde til baumannii? Den K1 kapsel-negative mutantstamme (AB307.30) stærkt kombineret med Anti-OmpA MAB ‘ er, hvilket antyder kapselpolysaccharider kan beskytte bindingsstederne for OmpA . Den dårlige kombination mellem mAbs og baumannii skal løses i det videre, og mAbs kan også bruges til andre konserverede epitoper af A. baumannii.