Acinetobacter baumannii (A. baumannii) causa infecciones adquiridas en hospitales (IAH), como neumonía asociada a ventilación mecánica, bacteriemia, infecciones del tracto urinario, meningitis e infecciones de heridas quirúrgicas, lo que conduce a un aumento de la mortalidad en los pacientes. Los factores de riesgo para estas infecciones incluyen ventilación mecánica, uso de antibióticos de amplio espectro, tiempo de permanencia en la UCI y coma . Estadísticamente, alrededor de 1,000,000 de personas en todo el mundo se infectaron con A. baumannii cada año, y la mitad de estas infecciones fueron causadas por cepas multirresistentes (MDR). La tasa de mortalidad de la infección por A. baumannii en la UCI fue de 45 a 60%, llegando incluso a 84,3% cuando los pacientes estaban infectados con resistencia extensa a los medicamentos (XDR) A. baumannii . En 2017, A resistente al Carbapenem. baumannii (CANGREJO) ocupó el primer lugar en términos de amenazas para la salud humana y la urgencia de desarrollar antibióticos relevantes, según la lista de bacterias resistentes a los medicamentos publicada por la OMS .

Sin embargo, la colistina (CST) y la tegaciclina, los antibióticos más utilizados contra la GNB productora de carbapenemasa, se han vuelto ineficientes debido a la resistencia a los antibióticos . Para lograr la eficacia clínica, los médicos tuvieron que aumentar la dosis de CST y combinarla con tegaciclina . Desafortunadamente, para bacteriemia e infecciones graves del tracto respiratorio causadas por CANGREJO y XDR-A. baumannii, respectivamente, la terapia combinada todavía no funcionó de manera efectiva . Frente a la grave resistencia bacteriana, los investigadores se han dado cuenta de que es urgente desarrollar nuevas estrategias antibacterianas en lugar de depender de los antibióticos tradicionales.

en General, hay dos formas de diseñar nuevos agentes antimicrobianos. El primero es inhibir la producción de sustancias esenciales para la supervivencia de las bacterias ; el otro es inhibir los factores de virulencia o los genes de resistencia a los antibióticos de las bacterias patógenas para suprimir la patogenicidad o mejorar su sensibilidad a los antibióticos . Sin embargo, la inhibición de un solo componente esencial inevitablemente provoca una gran presión evolutiva para las bacterias y promueve el desarrollo de cepas resistentes a los medicamentos de alto nivel . Por lo tanto, la nueva estrategia de intervención dirigida a los procesos no esenciales es la clave para superar la resistencia bacteriana . Por ejemplo, la inhibición de los sistemas de detección de quórum AbaI/AbaR con agentes inhibidores naturales o sintéticos bloquea la comunicación entre bacterias e inhibe la formación de biopelículas . Como una clase de factores de virulencia importantes en las bacterias, las proteínas de membrana externa (OMP) han atraído mucha más atención.

Las OMP son una clase de proteínas de membrana integrales únicas ancladas en el OM, cuyas estructuras de barril β estaban formadas por 8 a 26 hebras. Hay bucles grandes y extendidos entre las hebras en el lado extracelular y bucles cortos en el lado periplasmático. Estas características le dan a los OMPs una gran estabilidad en la membrana y la capacidad de luchar contra entornos extremadamente hostiles . Aunque las diferentes OMP poseen secuencias y funciones diferentes, comparten una estructura y propiedades biológicas similares . Los OMP de bacterias consisten en hebras de número par, y lo que es más importante, la función y el número de cizallamiento del soporte dependen de sus secuencias. Por ejemplo, como proteínas relacionadas con la virulencia, la proteína de unión al complemento OmpX en E. coli y la proteína de unión a fibronectina y heparina Ail en Yersinia pestis comparten una estructura similar comparable, pero su identidad de secuencia fue inferior al 45%. La diversidad de la secuencia de OMPs ocurre en el terminal N sustancialmente más que en el terminal C, y la señal β conservada controla el plegado y el correcto ensamblaje de OMPs .

Sin embargo, hasta ahora, los tipos de PMO en A. baumannii no se han identificado claramente, y solo se disponía de unos pocos informes dispersos, principalmente BamA, LptD, Omp33–36, OmpW. CarO y OprD. BamA como un OMP se puede insertar automáticamente en el OM y es responsable del ensamblaje de otros OMP ; LptD media el transporte de LPS a la membrana externa (OM), cuya pérdida puede causar la acumulación de intermedios y la ubicación de fallas de LPS, y eventualmente conducir a la interrupción de la integridad de la membrana bacteriana ; Omp33–36 es un canal para el paso de agua, que puede inducir la apoptosis de las células huésped activando la caspasa y regulando la autofagia ; OmpW es un tipo de porina hidrofóbica existente en OM y citoplasma, y desempeña un papel importante en la modulación de la homeostasis de iones de hierro en bacterias ; CarO y OprD están relacionados con resistencia del carbapenem .

Entre los OMP de A. baumannii, OmpA es el factor de virulencia más estudiado que desempeña un papel clave en la regulación de la adhesión, la agresividad y la formación de biopelículas de A. baumannii y la respuesta inmune del huésped. La sobreproducción de OmpA es un factor de riesgo independiente para la tasa de mortalidad de neumonía nosocomial y bacteriemia causada por A. baumannii . Además, el nivel de expresión de OmpA medido por qRT-PCR puede usarse como índice de diagnóstico rápido para A. baumannii resistente a los antibióticos, por lo que los resultados son altamente consistentes con los del análisis de CMI tradicional .

Esta revisión describió la estructura, la función y la patogénesis de AbOmpA, resumió las estrategias terapéuticas dirigidas a AbOmpA y destacó por qué AbOmpA es un objetivo potencial para el tratamiento de A. baumannii.

Estructura y función de la OmpA

La OmpA se identificó por primera vez como una proteína modificable por calor en Escherichia coli (E. coli) en 1974 y se purificó originalmente en 1977. Su masa molecular varía de 28 kDa a 36 kDa . La familia OmpA es un grupo de proteínas de porina expuestas a la superficie con un alto número de copias en Omps de GNB. El dominio N-terminal de OmpA es una estructura de barril β antiparalelar que consta de ocho filamentos transmembrana para incrustarse en la membrana externa. Las ocho hebras están conectadas por cuatro bucles largos en la superficie de la membrana externa y tres giros cortos en el dominio periplasmático formando el terminal C globular . Incluso en una cepa bacteriana específica, las secuencias de aminoácidos de OmpA son varias entre múltiples subclases .

En los últimos años, al aclarar la estructura nativa de AbOmpA, los investigadores han encontrado que los aminoácidos de AbOmpA de una variedad de aislados clínicos están altamente conservados (> 89%), mientras que no son homólogos del proteoma humano . Al comparar varias proteínas similares a OmpA, se identificaron los dos aminoácidos conservadores, R286 y Asp271, que se encuentran en el dominio C-terminal de OmpA. Ambos aminoácidos se unen de forma no covalente al aminoácido diaminopimelato (DAP), un componente del peptidoglicano (PGN) . Esta interacción sugiere que la OmpA juega un papel clave en el mantenimiento de la integridad de la superficie bacteriana. En general, en las especies de GNB, los OmpA estabilizan su estructura por autodimerización, lo que evita que se lisen las conexiones de flexión entre la estructura de barril β y la periplasmática .

AbOmpA es esencial para que A. baumannii se adhiera e invada a las células epiteliales

A. baumannii es capaz de entrar y persistir dentro de las células huésped. En primer lugar, se adhiere a las células huésped, luego invade y se traslada al núcleo. Después de matar las células huésped, se disemina en el torrente sanguíneo y los tejidos . AbOmpA media la adhesión e invasión de A. baumannii a las células epiteliales (Fig. 1a, panel superior). En comparación con las bacterias de tipo silvestre, la cepa isogénica mutante de AbOmpA es más difícil de invadir las células huésped. La preincubación con AbOmpA recombinante (rAbOmpA) inhibe drásticamente la adhesión y la invasión de A. baumannii 05KA103 altamente invasiva a las células epiteliales. E in vivo, la patogénesis se retrasa por la mutación de AbOmpA, ya que la evidencia mostró que hay menos carga bacteriana en la sangre de un modelo de neumonía murina . Para el mecanismo de adhesión de OmpA, Smani et al. encontraron que era más fácil para A. baumannii unir las placas de 96 pocillos recubiertas con fibronección que las recubiertas con ASC, e identificaron que la unión a proteínas con fibronección era OmpA, lo que indica que la unión de OmpA a firbronectina fue el primer paso de la interacción entre A. baumannii con las células huésped.

Funciones de OmpA en A. baumannii. un panel superior. Al entrar en contacto con las células epiteliales, las bacterias secretan OmpA en estas células. Los OmpA son capaces de translocarse en el núcleo y las mitocondrias, y estimulan a las mitocondrias para que liberen el citocromo c. Luego el citocromo c promueve que el factor inductor de apoptosis (AIF) se transloce en el núcleo y finalmente causa apoptosis de las células epiteliales. Panel inferior. La OmpA aumenta la producción de óxido nítrico sintasa (iNOS) y la expresión superficial del receptor tipo Toll 2 (TLR2) en las células epiteliales, los cuales desencadenan la muerte de las células huésped. b A baja concentración, OmpA activa DCs que luego estimula a las células T CD4 + para que ejerzan la respuesta Th1, mientras que a alta concentración; OmpA mata los DCs induciendo a las mitocondrias a liberar ROS. c AbOmpA puede detener el factor H sérico en el suero, causando la parálisis de la respuesta del complemento. d AbOmpA juega un papel dominante en la fijación de superficies abióticas y la formación de la matriz de biopelícula. e AbOmpA es una proteína de porina que se localiza en la membrana externa, permitiendo selectivamente la permeación de compuestos moleculares pequeños

AbOmpA podría causar directamente la muerte de las células huésped si se administra a las células huésped a través de las vesículas de la membrana externa (VMO) . Como se muestra en la Fig. 1a, después de entrar en las células huésped, AbOmpA puede localizar a las mitocondrias, lo que conduce a la liberación de moléculas (como el citocromo C, el factor inductor de apoptosis (AIF)) En las primeras etapas de la infección por A. baumannii, el AIF degrada el ADN cromosómico y facilita la apoptosis de las células epiteliales . Además, OmpA también puede translocarse al núcleo de células huésped dependiendo de su señal de localización nuclear monopartita (NLS)-«KTKEGRAMNRR», que se encuentra entre los residuos 320 y 330 de OmpA. Esta orientación subcelular de rAbOmpA puede inducir la apoptosis de las células huésped, pero el mecanismo subyacente específico no está claro . rAbOmpA purificada de A. baumannii ATCC19606 a una concentración de 6 µg / ml es suficiente para ejercer citotoxicidad en las células epiteliales laríngeas humanas HEp-2 . AbOmpA promueve que A. baumannii se adhiera e invada a las células huésped, lo que lleva a su muerte al localizarse en las mitocondrias y el núcleo, pero queda por explorar si AbOmpA funciona en otros orgánulos.

AbOmpA estimula la respuesta inmune innata

AbOmpA también influye en el sistema inmune del huésped. Aunque el tratamiento con AbOmpA no influye en el nivel de expresión de citoquinas o quimioquinas proinflamatorias, aumenta la producción de óxido nítrico sintasa (iNOS) y la expresión superficial del receptor Toll-like 2 (TLR2) en las células HEp-2 (Fig. 1a, panel inferior). Ambos son importantes en el mecanismo de defensa del anfitrión. El óxido nítrico (NO) ejerce funciones bacteriostáticas y bactericidas en la infección pulmonar , y este estrés oxidativo proporciona otro factor causal de la muerte celular. Y los TLRs reconocen los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) y desencadenan la respuesta inmunitaria . Los efectos de AbOmpA sobre las células dendríticas derivadas de la médula ósea (DCs) se ilustran en la Fig. 1b. AbOmpA a una concentración de 200 ng/ml activa el DCs a través de la vía TLR2, MAPK y NF-kB, estimulando las células T CD4+hacia una respuesta Th1 . Sin embargo, AbOmpA tiende a matar DCs en altas concentraciones (≥3 µg/mL) al aumentar las especies reactivas de oxígeno (ROS) de las mitocondrias . La inoculación con rAbOmpA podría inducir una respuesta inmunitaria de tipo 2 en ratones, lo que dañó el equilibrio entre la IL-4 y la INF-c y llevó a la aparición de infecciones . Además, AbOmpA paralizó el sistema de respuesta del complemento deteniendo el factor H sérico (Fig. 1c).

AbOmpA induce la formación de biopelículas

La biopelícula permite a A. baumannii sobrevivir en condiciones hostiles , consistentes principalmente en proteínas, ADN extracelular y polisacáridos. Según las estadísticas de los Institutos Nacionales de Salud y el Centro para la Prevención de Enfermedades, entre el 65% y el 80% de las infecciones humanas fueron causadas por bacterias formadoras de biopelículas . Sobre la base de las características multifuncionales de la formación de biopelículas, se identificaron una serie de genes asociados con la adhesión bacteriana y la formación de biopelículas, como AbOmpA, beta-lactamasa PER-1 (blaPER-1) y proteína asociada a biopelículas (Bap) . De hecho, el OmpA de A. baumannii ATCC19606 juega un papel dominante en la formación de biopelícula estable en la superficie plástica (Fig. 1d). Las cepas mutantes de AbOmpA no forman biofilm, mientras que la reposición del alelo AbOmpA restaura eficientemente la capacidad .

La permeación de antibióticos moleculares pequeños a través de AbOmpA

Las porinas son solo proteínas de barril β que se han encontrado en la membrana externa de la GNB. AbOmpA es la porina más abundante asociada con resistencia a medicamentos, unión de células epiteliales y formación de biopelículas . Smani et al. primero demostró el efecto de AbOmpA en el fenotipo de A. baumannii multirresistente, y encontró que el agotamiento del gen OmpA disminuyó los MICs de cloranfenicol, aztreonam y nalidixic en 8, 8 y 2,67 veces, respectivamente. Estos datos sugirieron que la OmpA puede participar en la extrusión de compuestos antibacterianos de la región periplasmática y acoplarse con sistemas de eflujo en la membrana interna . El transporte transmembrana controlado por porinas es una forma importante de entregar nutrientes y compuestos antibacterianos hidrófilos moleculares pequeños a las bacterias . Ramkumar et al. encontró que AbOmpA permitía selectivamente el paso de pequeños antibióticos moleculares (Fig. 1e). Por ejemplo, ETX2514, el inhibidor de β-lactamasa de amplio espectro, penetra a través de AbOmpA y mejora la actividad antibacteriana del sulbactam de una manera dependiente de AbOmpA. En el futuro, la clarificación de la estructura cristalina de AbOmpA revelará la relación entre la estructura preliminar del sustrato, la proteína de porina y la permeación, proporcionando más información para el diseño de sustratos moleculares pequeños .

Regulación de la expresión de AbOmpA

Entre los GNB, los factores que influyen en la expresión de OmpA se caracterizan principalmente en Escherichia coli, como nutrientes, condiciones de cultivo, infección por bacteriófagos y enzimas metabólicas . Sin embargo, todavía se están explorando los mecanismos de regulación de la OmpA de A. baumannii. Aunque los OmpA en GNB poseen una estructura similar de dos partes, las secuencias de aminoácidos ubicadas en la superficie externa de las bacterias son diversas entre diferentes géneros . Además de aprender de los estudios de E. coli, se supone que debemos explorar las características de OmpA en A. baumannii. En los últimos años, se ha demostrado que AbOmpA es una proteína de membrana externa relacionada con el estrés, cuya expresión se ve afectada por el entorno interno y externo de las bacterias . Durante el estudio de los efectos de la temperatura, la sequedad y la privación de nutrientes en la supervivencia a largo plazo de la cepa sensible ATCC19606 y los aislados clínicos, Bravo Z et al. se encontró que los genes relacionados con la adhesión y la formación de biopelículas, OmpA, bfmR y csuAB estaban todos regulados hacia abajo en células hambrientas, lo que provocó dificultades para formar biopelículas y la propagación de A. baumannii en la sangre . La proteína Hfq, un factor bacteriano huésped descubierto por primera vez en E. coi, es indispensable para la síntesis de ARN del bacteriófago Qb, y ahora se considera como un regulador transcripcional relacionado con las respuestas al estrés. La deficiencia de Hfq retarda el crecimiento celular y mejora la sensibilidad celular al estrés ambiental. El nivel de expresión de OmpA en la cepa mutante de Hfq es dramáticamente más bajo que en una cepa de tipo salvaje . Además, existe una correlación causal entre la formación de biopelículas y la expresión de AbOmpA en A. baumannii bajo tratamiento con antibióticos a concentraciones inhibitorias inferiores a las mínimas (CMI). Yoshinori et al. se incubaron ATCC19606 y aislados clínicos con 1/2 MIC de polimixina B (PMB) y colistina (CST) durante 24 h, respectivamente, y se encontró una correlación positiva entre el nivel de ARNm de AbOmpA y el número de células de biopelícula en la cepa ATCC19606 tratada con CST. Los mismos resultados se observaron en aislados clínicos R3 en presencia de PMB . Meropenem a la concentración de 64 µg/ml y 128 µg/mL aumentó la expresión de AbOmpA en 1,81 y 1,63 pliegues, respectivamente .

En general, hay tres factores que participan principalmente en la regulación de AbOmpA en estudios recientes. En primer lugar, los entornos desfavorecidos, como la inanición, disminuyen la producción de AbOmpA, lo que dificulta que A. baumannii forme biopelículas y se adhiera a las células huésped; En segundo lugar, el Hfq, un regulador transcripcional, cuyo nivel de expresión está estrechamente relacionado con el de AbOmpA; Finalmente, algunos antibióticos en la SUBMIC promueven la expresión de AbOmpA y la formación de biopelículas. Aunque se ha demostrado que varios factores están asociados con la expansión de OmpA en A. baumannii, los mecanismos subyacentes aún no se han explorado.

Estrategias terapéuticas dirigidas a AbOmpA

Polipéptido

Hoy en día, el pequeño polipéptido sintético que se une específicamente a OmpA se ha diseñado para evitar que A. baumannii entre en contacto con las células huésped. AOA-2, un hexapéptido cíclico como agente bloqueante de AbOmpA sin actividad bactericida, disminuye la adhesión de A. baumannii, Pseudomonas aeruginosa y E. coli a las superficies bióticas y abióticas, y aumenta significativamente la sensibilidad de A. baumannii al CST a la concentración de 125 µg/ml. In vivo, la inyección intraperitoneal de AOA-2 (10 mg/kg) en combinación con CST (10 mg/kg) mejoró la tasa de supervivencia de ratones con bacteriemia en un 20% . Además, se han descubierto gradualmente algunos péptidos antimicrobianos clásicos (AMPs) que interactúan con AbOmpA, que son una serie de péptidos de defensa endógena para matar bacterias y hongos . Por ejemplo, el péptido antimicrobiano mieloide bovino (BMAP-28) y sus péptidos análogos mataron a MDR-A. baumannii al interactuar con AbOmpA. Estos compuestos comenzaron a destruir A. baumannii a una concentración de 40 µg / mL en tan solo 15 minutos, y después de 30 minutos, las células bacterianas se dañaron obviamente con citoplasma con fugas . Además, el LL-37 interactuó con los residuos de aminoácidos 74-84 de AbOmpA de una manera dependiente de la dosis, disminuyendo la adhesión de A. baumannii a las células huésped. Sin embargo, este efecto inhibitorio de LL-37 sobre la adhesión se redujo en gran medida después de la deleción de AbOmpA . Defensa humana-5 (HD5) es un péptido endógeno que mata a MDR-A. baumannii. Con el fin de mejorar la actividad antibacteriana de HD5, los residuos no catiónicos y no hidrofóbicos fueron reemplazados por arginina cargada positivamente para obtener un derivado llamado HD5d5, que podría unirse fuertemente a AbOmpA y luego ejercer su función de neutralización de toxinas . Aunque hay evidencia de que el MDR-Staphylococcus aureus es resistente al LL-37 al producir enzimas catabólicas , no se ha reportado si A. baumannii podría desarrollar resistencia a los AMPs naturales. El pequeño péptido sintético, dirigido específicamente a AbOmpA sin actividad bactericida, puede evitar desencadenar la presión de evolución bacteriana y puede usarse solo o combinado con otros compuestos antibacterianos para ejercer efectos sinérgicos.

Vacuna

Como antígeno ideal de la vacuna, AbOmpA se conserva entre varias cepas clínicas con un genoma diferente del genoma humano . Luo G et al. se encontró que la inmunización de ratones con 3 µg rOmpA en hidróxido de aluminio al 0,1% (Al (OH)3) mejoró significativamente la tasa de supervivencia de animales diabéticos infectados por A. baumannii HUMC1 en un 40%, y disminuyó el recuento de colonias bacterianas de todos los órganos (excepto los pulmones) en diez veces, en comparación con el control. Además, el anticuerpo IgG contra rOmpA en suero también se mejoró dramáticamente . Badmasti F et al. demostró que la tasa de supervivencia de ratones con sepsis diseminada inducida por ATCC19606 mejoró notablemente (70%) después del tratamiento con región inmunodominante conservada recombinante de AbOmpA (8-346aa), y además, la combinación con Bap(1-487aa) también aumentó la tasa de supervivencia (> 80%) de ratones infectados por MDR AB-44 . Además, algunos derivados de AbOmpA con mayor antigenicidad y menor toxicidad fueron diseñados con herramientas bioinformáticas e inmunoinformáticas. Por ejemplo, se obtuvo un nuevo modelo inmunogénico con 12 hilos modificando secuencias de aminoácidos de OmpA, en el que K320 y K322 fueron sustituidos por Alanina, «NADEEFWN» fue reemplazado por «YKYDFDGVNRGTRGTSEEGTL», «VVQPGQEAAAPAAAQ» ubicado en la C-terminal y se eliminaron las posiciones 1-24 de la N – terminal. Este antígeno derivado de AbOmpA fue capaz de desencadenar la producción de anticuerpos que matan a Pseudomonas aeruginosa y A. baumannii . Otra forma es desarrollar una vacuna de ADN, que ha atraído más atención debido a su eficacia y durabilidad. La vacuna de ADN es considerablemente segura y tolerable porque no contiene patógenos debilitados o muertos durante su producción . Hossein et al. clonó el gen AbOmpA y lo insertó en un vector de expresión eucariótico pBudCE4.1 para obtener el pBudCE4.1–ompA recombinante. Después de transfectarse con este plásmido recombinante, las células de fibroblastos dérmicos humanos (HDF) expresaron efectivamente AbOmpA . A continuación, evaluaron el potencial inmunogénico de pBudCE4. 1-ompA en modelos de ratones. Después de la inmunización con esta vacuna, la IL-2, la IL-4, la IL-12, la IgM, la IgG y la INF-γ aumentaron drásticamente en el suero y sobrevivieron más animales en comparación con el grupo de control . Sin embargo, no debemos ignorar el potencial oncogénico de las moléculas recombinantes debido a su integración aleatoria en el genoma del huésped.

Anticuerpos monoclonales (mAbs)

Es ampliamente aceptado que los anticuerpos se pueden usar para defenderse contra infecciones microbianas. La inmunización pasiva inducida por anticuerpos dirigidos a AbOmpA solía considerarse como un método terapéutico potencial para las infecciones por MDR y XDR-A. baumannii . Sin embargo, el tratamiento con sueros policlonales anti-OmpA ha mostrado muchas deficiencias inevitables, como hipersensibilidad al complejo inmunitario, bajo contenido de anticuerpos específicos y el peligro potencial de propagación de enfermedades infecciosas . Recientemente, la tecnología de anticuerpos monoclonales (mAb) contribuye al desarrollo de MAB antibacterianos. En comparación con los sueros policlonales anti-OmpA, los MAB poseen más ventajas, como mayor seguridad, mejor homología y objetivos más específicos . Los mAbs dirigidos a OmpA promueven que los macrófagos maten a A. baumannii 307.30 (AB307.30), excepto los cubiertos con cápsulas gruesas, especialmente XDR-A. baumannii. La evidencia mostró que la unión de mAbs a aislados clínicos fue mucho más débil que la unión entre mABs y ATCC19606. Si la cápsula sobre la pared celular impide que los mAbs se unan a XDR-A. baumannii? La cepa mutante K1 con cápsula negativa (AB307. 30) se combina fuertemente con mAbs Anti-OmpA, lo que sugiere que los polisacáridos de la cápsula pueden proteger los lugares de unión de OmpA . La mala combinación entre mAbs y XDR-A. baumannii necesita ser resuelta en el futuro, y mAbs también se puede usar para otros epítopos conservados de A. baumannii.