genomin sekvensointihankkeiden loppuunsaattamisen kiihtyvä vauhti on lisännyt tarvetta käyttää suuritehoisia menetelmiä geeniekspression hallitsemiseksi. Yksi mahdollinen lähestymistapa on antisense-oligonukleotidien käyttö mRNA: n sitomiseen ja proteiinisynteesin estämiseen. Teoriassa tämä strategia mahdollistaa nopean etenemisen oligomeerien synteesistä fenotyypin havainnointiin . Käytännössä antisensiteettiteknologiaa on vaivannut taipumus epäspesifisiin vuorovaikutuksiin, ja nämä ovat hidastaneet sen laajaa soveltamista biologisiin tutkimuksiin . Viime aikoina oligonukleotidien kemiallisissa ominaisuuksissa ja niiden vaikutusmekanismia koskevassa ymmärryksessämme on kuitenkin tapahtunut parannuksia, joiden ansiosta niiden onnistunut käyttö on entistä todennäköisempää. Useiden laboratorioiden tutkimukset osoittavat nyt , että morfolinoligonukleotidit voidaan mikroinjektoida seeprakalaksi , merisiiliksi tai Ksenopusalkioiksi, joissa ne estävät geenien ilmentymisen ja aiheuttavat fenotyyppisiä vaikutuksia kehityksen alkuvaiheessa.

Morfoliinoligonukleotidit ovat ei-ionisia DNA-analogeja, joita on saatavilla Gene Tools LLC: ltä . Niillä on muuttunut selkärangan yhteydet verrattuna DNA tai RNA (Kuva (Kuvio1).1). Muuttuneesta selkärangastaan huolimatta morfolinot sitoutuvat Watson-Crick-emäsparin avulla toisiaan täydentäviin nukleiinihapposekvensseihin. Tämä sitoutuminen ei ole tiukempaa kuin analogisten DNA: n ja RNA: n oligomeerien sitoutuminen, mikä edellyttää suhteellisen pitkien 25-emäsisten morfolinojen käyttöä antisensiteettigeenin estoon. Selkäranka tekee morfolinoista vastustuskykyisiä nukleaasien aiheuttamalle ruoansulatukselle. Koska selkärangasta puuttuu myös negatiivinen varaus, ajatellaan, että morfolinot ovat vähemmän todennäköisesti vuorovaikutuksessa solujen proteiinien kanssa epäselektiivisesti; tällaiset vuorovaikutukset usein hämärtävät informatiivisten fenotyyppien havainnon. Morfolinojen vahvuudet selkärankaisten kehityksen tutkimisen työkaluina käyvät hyvin ilmi Ekkerin tuoreesta katsauksesta . Niiden suurin etu on se, että fenotyypit voidaan havaita nopeasti F0-eläimillä suhteellisen edullisella menetelmällä.

DNA: n ja morfolinoligonukleotidien rakenteet. R ja R’ tarkoittavat oligomeeriketjun jatkumista 5′ tai 3 ’ suunnassa.

suuri este antisense-oligonukleotidien käytölle on kohdesarjan valitseminen. Antisense-oligonukleotidit, jotka sisältävät DNA: ta, pystyvät muodostamaan RNA-DNA-hybridejä. Nämä hybridit voivat toimia substraattina RNaasi H: lle, joka edistää mRNA-tavoitteen pilkkoutumista. Koska RNA on hajonnut, mikä tahansa sekvenssi kohdegeenin koodausalueella voi olla hyödyllinen antisensaatiopaikka. Morfolinot sen sijaan muodostavat RNA-morfolinohybridejä, jotka eivät ole RNaasi H: n substraatteja, eikä mRNA näin hajoa. Tämä on tärkeä näkökohta, koska ribosomi syrjäyttää suurimmalle osalle koodausaluetta suunnatut morfolinot siirtyessään mRNA: ta pitkin, minkä vuoksi se on tehoton kääntämisen estämisessä. Morfolino-oligonukleotidit, jotka on suunnattu 5′ – transloitumattomalle alueelle (UTR) tai start-kodonille, saattavat toimia mieluiten estämällä käännöskoneiston sitoutumisen, mutta ei ole takeita siitä, että tämä on yleissääntö ja se on osoitettava empiirisesti jokaisen kohdegeenin kohdalla.

Ekker ja kollegat raportoivat, että fluoresenssilla merkittyjä morfolinoligonukleotideja voidaan ruiskuttaa palloasteisiin seeprakalan alkioihin ja saavuttaa tasainen jakautuminen. Vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) start-kodoniin kohdennetut morfolino-oligomeerit estivät GFP: n ilmentymisen, kun taas GFP: tä täydentävät kontrollioligomeerit eivät. GFP: n mRNA: n tasoa ei muutettu, mikä on odotettavissa, jos RNase H ei ole mukana. Nämä mallikokeet ovat merkittäviä, koska ne osoittavat morfolinoligomeerien kyvyn yksiselitteisesti estää geenien ilmentymistä sekvenssikohtaisesti. Ekker ja kollegat raportoivat myös useiden endogeenisten seeprakalan geenien estymisestä ja ovat alkaneet koota tietokantaa, jossa on yksityiskohtaisesti morfolinoligonukleotidien tuottamat fenotyypit .

Ekkerin ja kollegoiden morfoliinoilla tutkimia reittejä ovat muun muassa Sonic hedgehog ligandin kautta tapahtuva kehityssignalointi ja VEGF-a angiogeenisen kasvutekijän geenin ekspression vaikutus angiogeneesiin. Kaiken kaikkiaan ekkerin laboratoriossa on havaittu kiinnostavia fenotyyppejä 16: ssa 17 geenistä . Hammerschmidt ja kollegat ovat tutkineet tyypin I seriini/treoniinikinaasireseptorin geeniin Alk8/Lost-a-fin kohdistettuja morfolinoja. Lin ja työtoverit ovat raportoineet, että Fezin morfolinos, joka koodaa sinkkisormiproteiinia, voi vähentää dlx2: n ilmentymistä, joka koodaa homeodomainin sisältävää proteiinia, ventraalisessa etuaivossa. Kun tutkittiin ekspressiotasoja, saavutettiin merkittäviä geeniekspression ”knockdowneja” (jopa 90%).

muilla eliöillä kuin seeprakalalla Angerer ja kollegat ovat käyttäneet morfolinoja, jotka on suunniteltu estämään β-kateniinin säätelyn transkriptiotekijän spkr1: n translaatio merisiilin alkioissa . Kuten nasevicius et al. positiivisena kontrollina käytettiin GFP-ekspression ”knockdownia”, ja 4 µM: n anti-SpKr1 morfolinon käyttöönotto johti endodermin erilaistumisen epäonnistumiseen. Heasman ym. ovat tutkineet β-catenin signalointia Xenopuksessa . Injektio 2-tai 4-soluisessa vaiheessa estää selkäakselin muodostumisen, kun taas injektio 8-soluisessa vaiheessa estää pään muodostumisen . Lopuksi Erickson ja kollegat ovat käyttäneet elektroporaatiota foxd3: a vastaan suunnattujen morfoliinojen toimittamiseen poikasen alkioille. FoxD3 on siivekäs-helix-luokan transkriptiotekijä, ja morfoliinojen käyttöönotto muuttaa hermosto-crest-solujen etenemistä, mikä on yhdenmukainen foxd3: n lokalisoinnin kanssa . Nämä kokeet havainnollistavat morfolinojen mahdollisuutta pilkkoa tarkasti kehityksen ajallinen eteneminen. Estettäessä tuntemattoman funktion geeniä tai havaittaessa odottamatonta tulosta on kuitenkin tärkeää pitää mielessä, että uusi fenotyyppi ei välttämättä johdu kohdegeenin ilmentymisen vähenemisestä. Tämä varoitus on läsnä myös tavanomaisissa geneettisissä tyrmäyksissä, ja se tarkoittaa yksinkertaisesti sitä, että tuloksia on tulkittava varovaisesti.

nämä tiedot ovat provokatiivisia ja viittaavat siihen, että ainakin näissä eläinmalleissa morfolinonesteoligomeereista voi tulla rutiinivälineitä mutanttifenotyyppien tuottamiseen. On kuitenkin tärkeää ymmärtää, että antisensiteettitekniikka harvoin, jos koskaan, toistaa täydellisiä ”toimintakyvyttömiä” mutaatioita. Varoitamme myös siitä, että antisensiteettireagensseja on käytetty laajalti väärin aiemmin. Kontrollit ovat olleet puutteellisia, tulokset ovat usein marginaalisia, ja havaittujen fenotyyppien on usein havaittu johtuvan monenlaisista odottamattomista ei-antisensiivisistä mekanismeista. Näiden ei-antisense-vaikutusten syitä ovat tahattomat vuorovaikutukset proteiinien kanssa ja sitoutuminen ei-kohde-nukleiinihapposekvensseihin . Tämän vuoksi on välttämätöntä, että menetelmää sovelletaan huolellisesti, jotta vältytään toistamasta aiempia virheitä, jotka ovat hidastaneet antisensiteettiteknologian kehitystä.

kuten kaikissa antisense-kokeissa, myös epäspesifisten vaikutusten tarkka valvonta on tärkeää fenotyyppien asianmukaisen tulkinnan kannalta. Morfolinoligonukleotideilla tehdyissä kokeissa on aina testattava vähintään yksi epäsuhta ja yksi kontrollioligomeeri, ja näiden testien tulokset on raportoitava. Myös annos-vaste-määritykset tietyn fenotyypin induktion ja toksisuuden alkamisen välisen rajan määrittämiseksi ovat tärkeitä. Tämä marginaali voi esimerkiksi olla alle kaksinkertainen, mikä korostaa tarkoin valvotun annoksen määrittämisen ja täsmällisen kvantitatiivisen toimituksen tarvetta. Sekä kohdeproteiinin että yhden tai useamman kontrolliproteiinin pitoisuudet on mahdollisuuksien mukaan arvioitava näytteistä, jotka on käsitelty kokeellisilla morfolinoilla ja kontrolliproteiineilla. Lisäksi Ekker ehdottaa, että tulokset varmistettaisiin mRNA rescue-menetelmällä ja/tai vertaamalla olemassa olevien mutanttien fenotyyppejä .

morfolinoligonukleotidien suorittaman geeniekspression eston suuri onnistumisprosentti on yllättävä. Antisensiteettikentän opinkappale on, että ATG-aloituspaikan kohdentaminen ei ole varma menestysresepti, ja että jopa 40 oligonukleotidia on ehkä testattava sellaisen tunnistamiseksi, joka estää tehokkaasti geenien ilmentymistä . Jos käynnistyskodonin kohdentaminen toimii niin hyvin, miksi useammat tutkijat eivät tee tätä sen sijaan, että turvautuisivat taidokkaisiin näyttöihin? Morfolinot saattavat olla tehokkaampia kuin muut antisensiteettikemikaalit, mutta miksi? Jälkimmäistä kysymystä on käsiteltävä tutkimalla järjestelmällisesti niiden ominaisuuksia ja vertaamalla niitä muihin oligonukleotidityyppeihin. Dramaattisesti muuttunut morfolino-selkäranka voi ehkä sitoutua mRNA: han tehokkaammin tai toimia kääntämisen parempana esteenä. Jos näin on, morfolinot voivat olla parempia geenien inhibitioaineita verrattuna muihin oligomeereihin, jotka saattavat estää translaation, kuten lukittuun nukleiinihappoon (LNA), peptidinukleiinihappoon (PNA) tai 2′-modifioituun RNA: han . Toisaalta muuntyyppiset oligomeerit saattavat toimia yhtä hyvin tai paremmin kuin morfolinot, mutta niiden potentiaali voi olla vähäisempi, koska niitä ei ole testattu suotuisissa kokeellisissa järjestelmissä.

epäspesifisistä yhteisvaikutuksista johtuvat harhaanjohtavat havainnot ovat sekoittaneet paljon aiempia oligonukleotideilla tehtyjä tutkimuksia . Nämä vaikeudet ovat saaneet monet tutkijat epäilemään oligonukleotidien käyttöä perustutkimuksen välineenä. Viimeisten 18 kuukauden aikana julkaistut tutkimukset viittaavat kuitenkin siihen, että morfolino-oligomeereilla voi olla ominaisuuksia, joiden avulla tutkijat voivat rutiininomaisesti tuottaa opettavia fenotyyppejä. Tulokset ovat jännittäviä, sillä morfolino-oligomeerit voivat tarjota yleisesti sovellettavan työkalun kemialliseen genetiikkaan ja funktionaaliseen genomiikkaan. Tämän potentiaalin toteuttamiseksi on määritettävä näiden reagenssien tehoa säätelevät ominaisuudet. Näiden tietojen avulla tutkijat voivat optimoida menetelmät ja saavuttaa mahdollisimman ’knockdown’ tietyn tavoitteen minimoiden sekoittavia, epäspesifisiä vaikutuksia. Morfolino-oligomeerien käyttäjien on ymmärrettävä antisensiteettikenttää aiemmin vaivanneet ongelmat, opittava näistä takaiskuista ja tehtävä asianmukaisia kontrollikokeita. Nämä kontrollikokeet, vähintään yhtä paljon kuin kiinnostavien fenotyyppien tuottaminen, ratkaisevat, ovatko morfolinoligonukleotidit se läpimurto, jonka tuore tutkimus antaa ymmärtää.