Abstrakti

bakteerien koko genomin sekvensointi on tuottanut runsaasti profagisekvenssejä sivutuotteena, ja näiden sekvenssien analyysi paljasti tapoja, joilla fagit ovat vaikuttaneet isäntäbakteeriensa genomiin eri bakteerilajeissa. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tunnistaa faageihin liittyvät sekvenssit siipikarjassa tarttuvan coryzan aiheuttavan Avibacterium paragallinarum-genomin luonnoskokoonpanossa. Koko genomin kokoaminen ei ollut mahdollista, koska kontigien päissä oli aukkoja ja/tai toistoja. Kuitenkin genomin merkintä paljasti profage ja profage jäänne sekvenssejä läsnä tässä genomi. Saatujen tulosten perusteella voitiin tunnistaa täydellinen Mu-kaltainen bakteriofagi, jota kutsuttiin AvpmuC-2m: ksi. myös HP2: n kaltaisen bakteriofagin täydellinen sekvenssi, nimeltään AvpC-2m-HP2, tunnistettiin.

1. Johdanto

bakteriofagit löysi ensimmäisenä Englannissa vuonna 1915 Frederick W. Twort ja itsenäisesti vuonna 1917, Felix D ’ Herelle, Pasteur Institute Pariisissa . Bakteriofagit ovat bakteereja infektoivia viruksia, jotka voidaan jakaa bakteerisolun kanssa vuorovaikutustapojensa mukaan kahteen ryhmään, eli lyyttisiin (virulenteihin) ja lauhkeisiin (lysogeenisiin) fageihin. Lyyttiset fagit etenevät tyypillisesti replikaatiolla isäntäsolun tartuttamisen jälkeisenä hetkenä, jolloin isäntäsolun lyysin kautta vapautuu suuria määriä uusia viruksia. Lauhkean vyöhykkeen fagit eivät välttämättä aloita replikaatiota heti tartunnan jälkeen, ja useista olosuhteista riippuen nämä fagit saattavat integroida kromosominsa isäntäsolun genomiin pysyen näin hiljaa indusoitumiseen asti . Kun bakteriofagien genomi on integroitu isäntäsolun genomiin, sitä kutsutaan ennustukseksi. Profetiat ovat pääepäiltyjä olemassa olevien taudinaiheuttajien sopeutumisessa uusiin isäntiin tai uusien taudinaiheuttajien tai epidemiakloonien syntymisessä . Bakteereilla ei ole suvullista elinkaarta ja alleelien vaihto populaation sisällä tapahtuu horisontaalisen geeninsiirron kautta, ja tämän DNA: n lähde voi olla muun muassa fageja . Näistä lähteistä voidaan tuoda kokonaisia toiminnallisia yksiköitä, ellei lajirajoitus rajoita niitä, ja siirretyn DNA: n koko voi vaihdella 1 kb: Sta yli 100 kb: iin ja se voi koodata monimutkaisia pintarakenteita tai jopa kokonaisia aineenvaihduntareittejä . On jo pitkään todettu, että bakteriofagit edistävät bakteeriisäntiensä patogeenisuutta, sillä monien geenien on osoitettu siirtyvän bakteerien kesken fagien välityksellä . Nämä geenit voivat koodata erilaisia virulenssitekijöitä, kuten toksiinia, säätelytekijöitä (jotka säätelevät isäntävirulenssigeenien ilmentymistä) ja entsyymejä, jotka voivat muuttaa bakteerien virulenssikomponentteja .

bakteerien koko genomin sekvensointi on tuottanut runsaasti ennustussekvenssejä . Profages voi muodostaa niin paljon kuin välillä 10 ja 20% bakteerin genomin vaikka monet näistä profages ovat kryptisiä ja tilassa mutaatio rappeutuminen . Näiden jaksojen analyysi paljasti lukuisia tapoja, joilla profetiat muokkaavat isäntäbakteeriensa perimää . Profeteilla on kyky vaikuttaa isäntägenomiarkkitehtuuriinsa muuttamalla genomin sisältöä, muokkaamalla genomin organisaatiota tai muuttamalla geenien sijaintia ja järjestystä . Lauhkean vyöhykkeen bakteriofageilla on monimutkainen rooli mikrobien moninaisuuden synnyssä ja bakteerien genomien kehityksessä bakteerin kromosomin sisällä tapahtuvan uudelleenjärjestäytymisen välityksellä, minkä seurauksena ne edistävät merkittävästi saman bakteerilajin sisäisiä aivojenvälisiä eroja . Vertailun vuoksi kaksi Streptococcus pyogenes—kantaa kuuluvat eri M-serotyyppeihin, eivätkä ne liity mitenkään eri tauteihin-mutta kun näitä kantoja verrattiin DNA-tasolla, keskeiset erot korreloivat profage-sekvensseihin . Toinen esimerkki voidaan havaita kampylobakteeri jejunissa, jossa aivojenväliset erot voivat johtua Mu: n kaltaisten ennustus-DNA-sekvenssien genomisesta inversiosta . Kolineaaristen genomien väliset vertailut osoittivat, että relevanttien genomien väliset erot johtuivat profagisekvenssien esiintymisestä tai uudelleen järjestettyjen bakteerien genomien seurauksena . Monissa tapauksissa profetiat, joilla on rajoitettu DNA-sekvenssin identiteetti, tai kahdennetut profetiat toimivat homologisen rekombinaation ankkurointipisteinä . Lisäksi profetiat voivat yhdistyä muiden profetioiden kanssa, jotka vaikuttavat niiden mosaiikkirakenteeseen .

Avibacterium paragallinarum on kanoille suunnattu taudinaiheuttaja, joka aiheuttaa tarttuvan coryza-taudin . Fylogeneettisesti tämä bakteeri kuuluu Pasteurellaceae-heimoon ja tunnettiin aiemmin nimellä Haemophilus paragallinarum, joka nimettiin uudelleen vuonna 2005 . Heimo Pasteurellaceae koostuu läheistä sukua olevista bakteereista ja tässä heimossa on raportoitu erilaisia bakteriofageja Haemophilus influenzae -, Actinobacillus actinomycetemcomitans -, Pasteurella multocida-ja Mannheimia haemolytica-bakteereissa. Histophilus somni-bakteerin kaltaisia sekvenssejä on raportoitu . Tässä asiakirjassa, kuvailemme profetoida ja profetoida jäänteitä havaittu Av. paragallinarum.

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1. Bakteerikannat ja kasvuolosuhteet

Av. paragallinarum kanta C-2 (Modesto) saatiin Onderstepoort Biological Products, Onderstepoort, Etelä-Afrikka. Kanta Modesto on nad+ riippuvainen ja sitä viljeltiin TM/Sn täydennettynä 1% (v/v) kanaseerumilla, 1% (v/v) nad+: lla ja 0,0005% (m / v) tiamiiniliuoksella ja viljeltiin happea rajoittavissa olosuhteissa kynttiläpurkissa 37°C: ssa 16 tunnin ajan .

2, 2. DNA-uutto

genomisen DNA: n uutto suoritettiin Qiagenista otetulla QIAamp DNA Mini-paketilla. Valmistajan suosituksia noudatettiin huolellisesti lukuun ottamatta eluutiomenetelmää, jossa genomi-DNA eluoitiin 2 × 80 µL 10 mM Tris-HCl: ssä, pH 8.

2, 3. AV: n tunnistetiedot. paragallinarum

Av. paragallinarum tunnistettiin nimenomaan tätä bakteeria varten kehitetyn PCR-protokollan avulla . Lisäksi 16S: n ribosomaalinen DNA (rDNA) – alue monistettiin Av: n tunnistamiseksi. paragallinarum . Saatu PCR-tuote erotettiin agaroosigeelistä, puhdistettiin ja sekvensoitiin suoraan mahdollisen vieraan genomin DNA-kontaminaation välttämiseksi.

2, 4. Genomin kokoonpano ja merkintä

Av: n genomiset DNA-näytteet. paragallinarum kanta C-2 (Modesto) lähetettiin Agowa Genomics (nykyisin LGC Genomics), Saksa, varten GS-FLX titaani pyrosequencing. Sekvenssit / lukemat saatu pyrosequencing koottiin käyttäen Newbler 2.0.01.14 alkaen 454 Life Sciences Corporation kanssa päällekkäisyys vähintään ottelu identiteetti 90% ja päällekkäisyys vähintään ottelu pituus 40 emäkset. Sekvenssit saatu kontigs toimitettiin J. Craig Venter Institute (JCVI) kuin pseudomolecule annotation. Putki sisältää geenin löytäminen Glimmer , BLAST-Extend-Repraze (Ber) haut , Piilotettu Markov mallit (HMM) haut , Trans kalvo Piilotettu Markov mallit (TMHMM) haut , SignalP ennustukset, ja automaattinen merkinnät AutoAnnotate. Kaikki nämä tiedot tallennetaan MySQL-tietokantaan ja siihen liittyviin tiedostoihin, jotka ladattiin sivustollemme. Manuaalinen merkintätyökalumanaatti ladattiin SourceForgesta (http://manatee.sourceforge.net/) ja sitä käytettiin putken tuotoksen manuaaliseen tarkasteluun. acaclone Softwaren pdraw32: ta käytettiin profage-alueen geneettisten karttojen piirtämiseen.

2, 5. Liittymisnumerot

AvpmuC-2m (liittymisnumero: JN627905); HP-2: n kaltaiset profetiat contig a (JN627906), B (JN627907) ja C (jn627908); lamboid-profetian fragmentit (liittymisnumerot: jn627909-JN627919); profagi-integraasigeenit (liittymisnumerot: JN627920-JN627928).

3. Tulokset ja keskustelu

Av: n koko genomin sekvensointiprojekti. paragallinarum tuotti yhteensä 160 743 lukua/sekvenssiä pyrosekvenssikemian kautta. Näistä sekvensseistä koottuja kontigeja oli yhteensä 300, joista suurin contig käsittää 78 465 bp ja keskimääräinen yli 500 bp pitempi contig-koko oli 10 727 bp. Av: lle ei voitu koota suljettua genomia. paragallinarum alkaen sekvensoinnin tulokset saatu, koska toistuvia sekvenssejä, jotka olivat olemassa lopussa (s) contigs tai seurauksena sekvenssin aukkoja contigs. Saaduista 300 kontigista koottiin pseudogenomimolekyyli, joka lähetettiin jcvi: lle genomihuomautuksia varten. Huomautusten tulokset osoittivat, että yhteensä 7% eli 141 avointa lukukehystä annettiin faagiproteiinin funktioille. 141 avointa lukukehystä tunnistettiin 60: ssä niistä 300 kontigista, joissa kartoitettiin joko yksi tai sarja profagegeenejä. Yhdeksän prophage integrase-geeniä tunnistettiin ja kartoitettiin seitsemään 60 kontigista. Tutkimukset tunnistettujen integraasien viereisillä avoimilla lukukehyksillä eivät paljastaneet muita profageen liittyviä geenejä, vaan kalvoproteiineja; metabolisia proteiineja; ribosomaalisia proteiineja koodaavia geenejä; solukalvon funktioproteiinit eli kalvovientiproteiinit. Integraasien välillä ei havaittu merkittävää homologiaa.

Mu-tyyppiset profagegeenit tunnistettiin ja kartoitettiin 11 eri kontigiin. 11 kontigia verrattiin Mu-tyyppisten fagien genomikarttaan, jonka raportoi. Tässä ehdotamme oletettua Mu: n kaltaista ennustusta Av: lle. paragallinarum, AvpmuC-2m (Kuva 1). Suuri osa Mu-geenistä (25) tunnistettiin yhdestä kontigista, joka käsitti 27, 107 bp. Lisäksi tunnistettiin kaksi muuta kontigia, jotka täydensivät MU: n kaltaisen ennustuksen kartan Av: lle. paragallinarum.

neljäkymmentäyksi lamboidigeeniä kartoitettiin 11 eri kontigiin (kuva 2). Koko genomin sekvensointiprojektista saaduilla tiedoilla ei voitu päätellä, onko lamboidin profetia täydellinen tai onko se kokenut massiivisen funktionaalisen DNA: n menetyksen, joka johtaa bakteriofagien genomin pirstoutumiseen ja lopulta sen katoamiseen .

lauhkean faasin täydellinen lysogeeni tunnistettiin yhdestä genomin sisältämästä kontigista. Tunnistettujen geenien perimä on samankaltainen kuin H. influenzae HP2 prophagella. Nukleotidi-nukleotidi-vertailu paljasti heikon samankaltaisuuden H. influenzae-ennusteen HP2: n ja tunnistetun ennusteen välillä. Yksilöity profetia on sen tähden ainutlaatuinen Av: lle. paragallinarum. Suosittelemme kutsumaan sitä AvpC-2M-HP2.

kahdessa muussa kontigissa oli myös HP2: n kaltaisia geenejä (kuva 3). Lisätutkimukset samankaltaisuudesta tunnistettujen kontigien (A, B ja C ACPC-2M-HP2) välillä osoittivat, että näillä kolmella kontigilla on sama genominen organisaatio, mutta ne eivät ole identtisiä.

(a)

(b)

(C)

(a)
(b)
(C)

on myös tunnistettu runsaasti muita profagegeenejä, mutta niitä ei ole voitu osoittaa mihinkään tiettyyn faagiperheeseen tai fagiperheeseen.

näin kaikkien paljastuneiden profagegeenien kartoittaminen antoi meille mahdollisuuden ehdottaa kahta profagiaa Av: ssa. paragallinarum. Toinen ennustus, AvpmyC-2m, muistuttaa Mu-tyyppistä ennustusta, kun taas toinen ennustus, AvpC-2m-HP2, muistuttaa H. influenzaen HP2-ennustusta.

eturistiriidat

kirjoittajat julistavat, ettei eturistiriitoja ole minkään paperissa mainitun kaupallisen identiteetin kanssa.

kuittaus

kirjoittajat haluavat kiittää JCVI: tä siitä, että se tarjosi heille jcvi-Merkintäpalvelun, joka tarjosi heille automaattisen merkintätiedon ja manuaalisen merkintätyökalun Manaatin.