Abstrakt

Bakteriální sekvenování celého genomu přinesl hojnost prophage sekvence jako vedlejší produkt a analýza těchto sekvencí odhalila způsoby, v nichž fágů ovlivnily genomu hostitelské bakterie v různé bakteriální druhy. Cílem této studie bylo identifikovat phage-související sekvence v návrhu shromáždění Avibacterium paragallinarum genomu, původce infekční rýma u drůbeže. Sestavení celého genomu nebylo možné kvůli přítomnosti mezer a / nebo opakování existujících na koncích spojů. Nicméně, anotace genomu odhalila prophage a prophage zbytkové sekvence přítomné v tomto genomu. Z dosažených výsledků, kompletní Mu-jako bakteriofága může být zjištěno, že byl nazván AvpmuC-2M. Kompletní sekvence HP2-jako bakteriofág, jménem AvpC-2M-HP2, byl také identifikován.

1. Úvod

bakteriofágy byly poprvé objeveny v Anglii v roce 1915 Frederickem W. Twort a nezávisle na něm v roce 1917 Felixem D ‚ Herellem v Pasteurově institutu v Paříži . Bakteriofágy jsou viry, které infikují bakterie a mohou být rozděleny do dvou skupin podle jejich prostřednictvím interakce s bakteriální buňky, a to, lytické (virulentní) a mírné (lysogenic) bakteriofágy. Lytické fágů pokračovat typicky s replikace v okamžiku, kdy po infikování hostitelské buňky, kde velký počet nových virů jsou uvolňovány prostřednictvím lýze hostitelské buňky. Mírných fágů nemusí nutně začít replikace okamžitě po infekci, a v závislosti na řadě podmínek, tyto bakteriofágy mohou integrovat jejich chromozomů do genomu hostitelské buňky tak mlčet, dokud indukované . Jakmile je genom bakteriofága integrován do genomu hostitelské buňky, označuje se jako prophage. Prophages jsou hlavními podezřelými v případě adaptace stávajících patogenů na nové hostitele nebo vzniku nových patogenů nebo epidemických klonů . Bakterie nemají sexuální životní cyklus a výměna alel v populaci je splněna horizontálním přenosem genů a zdrojem této DNA mohou být mimo jiné fágy . Pokud není omezen druh bariéry, celé funkční jednotky mohou být importovány z těchto zdrojů a převedeny DNA může být v rozsahu od 1 kb do více než 100 kb ve velikosti a může kódovat složité povrchové struktury, nebo dokonce i celé metabolické dráhy . To dlouho bylo zjištěno, že bakteriofágy přispívají k patogenitě jejich bakteriální hostitelé jako mnoho genů bylo prokázáno, že podstoupit přenos mezi bakterie pomocí fágů . Tyto geny mohou kódu pro rozmanité podmnožinu faktorů virulence, jako jsou toxiny, regulační faktory (které upregulate vyjádření hostitele, virulence geny), a enzymy, které mohou ovlivnit bakteriální virulence komponenty .

sekvenování bakteriálního celého genomu přineslo množství prorockých sekvencí . Proroctví mohou představovat až 10 až 20% genomu bakterie, i když mnoho z těchto proroctví je kryptických a ve stavu mutačního rozpadu . Analýza těchto sekvencí odhalila řadu způsobů, jak prophages formují genom jejich hostitelských bakterií . Proroci mají schopnost ovlivnit architekturu hostitelského genomu změnou obsahu genomu, úpravou organizace genomu nebo změnou umístění a pořadí genů . Mírné bakteriofágy hrát složitou úlohu ve vzniku mikrobiální rozmanitost a evoluce bakteriálních genomů prostřednictvím přeskupení v rámci bakteriální chromozom a jako výsledek se významně přispěje k interstrain rozdíly v rámci stejné druhy bakterií . Pro srovnání, dva kmeny Streptococcus pyogenes patří do různých M sérotypy a jsou unconnectedly spojené s různými nemocemi—ale když tyto kmeny byly srovnávány na úrovni DNA hlavní rozdíly souvisí s prophage sekvence . Dalším příkladem může být pozorován v Campylobacter jejuni, kde interstrain rozdíly lze přičíst k intra-genomických inverzí Mu-jako prophage sekvence DNA . Srovnání mezi smysluplný genomů ukázaly, že mezery mezi příslušnými genomy byly připisovány přítomnosti prophage sekvence nebo jako výsledek upravil bakteriální genomy . V mnoha případech proroctví s omezenou identitou sekvence DNA nebo duplikované proroctví slouží jako kotevní body pro homologní rekombinaci . Kromě prophages lze rekombinovat s jinými prophages přispívající k jejich mozaikové struktuře .

Avibacterium paragallinarum je patogen zaměřený na kuřata a způsobuje onemocnění infekční coryza . Fylogeneticky tato bakterie patří do čeledi Pasteurellaceae a byla dříve známá jako Haemophilus paragallinarum přejmenovaná v roce 2005 . Rodiny Pasteurellaceae se skládá z úzce souvisí bakterie a v rámci této rodiny, různé bakteriofágy byly hlášeny u Haemophilus influenzae, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Pasteurella multocida a Mannheimia haemolytica. U Histophilus somni byly hlášeny sekvence podobné bakteriofágům . V tomto článku, popisujeme zbytky prophage a prophage detekované v Av. paragallinarum.

2. Materiály a metody

2.1. Bakteriální kmeny a růstové podmínky

Av. paragallinarum kmen C-2 (Modesto) byl získán z biologických produktů Onderstepoort, Onderstepoort, Jihoafrická republika. Kmen Modesto je NAD+ dependentní a byla pěstována v TM/SN doplněny s 1% (v/v) kuřecí sérum, 1% (v/v) NAD+, a 0.0005% (m/v) thiamin řešení a pěstuje podle kyslíku omezující podmínky v candle jar při 37°C po dobu 16 h .

2.2. Extrakce DNA

extrakce genomové DNA byla provedena za použití Mini kit QIAAMP DNA od společnosti Qiagen. Doporučení výrobce byla pečlivě dodržována s výjimkou postupu eluce, kdy byla genomová DNA eluována v 2 × 80 µL 10 mM Tris-HCl, pH 8.

2.3. Identifikace Av. paragallinarum

Av. paragallinarum bylo identifikováno pomocí protokolu PCR vyvinutého speciálně pro tuto bakterii . Kromě toho byla oblast 16S ribozomální DNA (rDNA) amplifikována za účelem identifikace Av. paragallinarum . Získaný produkt PCR byl vyříznut z agarózového gelu, vyčištěn a přímo sekvenován, aby se zabránilo možné kontaminaci cizí genomové DNA.

2.4. Sestavení a anotace genomu

vzorky genomové DNA Av. paragallinarum kmen C-2 (Modesto) byl poslán do Agowa Genomics (nyní známý jako LGC Genomics), Německo, pro GS-FLX Titanium pyrosekvenování. Sekvence/čte získané z pyrosequencing byly sestaveny pomocí Newbler 2.0.01.14 z 454 Life Sciences Corporation s přesahem minimálně zápas identitu 90% a přesahem minimálně odpovídat délce 40 základen. Sekvence získaných spojů byly předloženy Institutu J. Craiga Ventera (JCVI) jako pseudomolekula k anotaci. Potrubí zahrnuje gen najít s Záblesk , VÝBUCH-Extend-Repraze (BER) vyhledávání , Skryté Markovovy Modely (HMM) vyhledávání , Trans Membránové Skryté Markovovy Modely (TMHMM) vyhledávání , SignalP předpovědi a automatické popisy z AutoAnnotate. Všechny tyto informace jsou uloženy v databázi MySQL a souvisejících souborech, které byly staženy na naše stránky. Ruční anotační nástroj Manatee byl stažen ze SourceForge (http://manatee.sourceforge.net/) a použit k ruční kontrole výstupu z potrubí. pDraw32 ze softwaru ACACLONE byl použit k kreslení genetických map pro oblast prophage.

2.5. Přístupová čísla

AvpmuC-2M (přístupové číslo: JN627905); HP-2 jako prophages contig (JN627906), B (JN627907), a C (JN627908); lamboid prophage fragmenty (přístupová čísla.: JN627909-JN627919); prophage integrázy geny (přístupová čísla.: JN627920-JN627928).

3. Výsledky a diskuse

celý projekt sekvenování genomu Av. paragallinarum získalo celkový počet 160 743 čtení / sekvencí prostřednictvím pyrosekvenční chemie. Celkový počet contigs sestaven z těchto sekvencí byla 300 s největší contig obsahující 78 465 bp a průměrná contig velikost delší než 500 bp, 10 727 bp. Uzavřený genom nemohl být sestaven pro Av. paragallinarum z řazení výsledků získaných v důsledku opakovaných sekvencí, které existovaly na konci(s) contigs nebo v důsledku mezer mezi contigs. Molekula pseudogenomu byla sestavena ze získaných 300 spojů a byla odeslána do JCVI pro anotaci genomu. Výsledky anotace ukázaly, že k funkcím fágového proteinu bylo přiděleno celkem 7% nebo 141 otevřených čtecích rámců. 141 otevřených čtecích rámců bylo identifikováno na 60 z 300 spojů, kde byl mapován jeden nebo řada genů prophage. Devět genů prophage integrase bylo identifikováno a mapováno na sedm z 60 spojů. Vyšetřování open reading frames přiléhající k identifikovány integrases neodhalily žádné další prophage-související geny, ale spíše geny kódující membránové proteiny; metabolické proteiny, ribosomální proteiny; buněčné membránové funkční proteiny nebo membránové exportní proteiny. Mezi integrázami nebyla pozorována žádná významná homologie.

mu-like prophage geny byly identifikovány a mapovány na 11 různých spojů. The 11 contigs byly porovnány s genomovou mapou fágů podobných Mu hlášených . Zde navrhujeme domnělý mu-like prophage pro Av. paragallinarum, AvpmuC-2M (Obrázek 1). Velká část genu Mu (25) byla identifikována na jediném contigu obsahujícím 27 107 bp. Byly identifikovány dvě další souvislosti, které vyplňovaly mapu mu-jako prophage pro Av. paragallinarum.

Obrázek 1

Domnělé genomu zastoupení AvpmuC-2M. Tři contigs, které byly použity v konstrukci AvpmuC-2M jsou odděleny //. Velikosti Contig jsou uvedeny pod každým contigem v párech bází.

čtyřicet jedna lamboidních genů bylo mapováno na 11 různých spojích (Obrázek 2). S data k dispozici z celého sekvenování genomu, projekt nemohl být učiněn závěr, pokud lamboid prophage je kompletní, nebo jestli to prošlo rozsáhlou ztrátu funkční DNA, což v genomu bakteriofága fragmentace a nakonec povede k jeho zmizení .

Obrázek 2

Lamboid genetické zastoupení. Různé lambda geny byly mapovány na kontigy, ze kterých byly identifikovány a seskupeny podle přidružených funkcí . Počátky a konce spojů jsou označeny//.

kompletní lysogen mírného fága byl zjištěn na jediném contig v rámci genomu. Posloupnost identifikovaných genů je podobná posloupnosti h. influenzae HP2 prophage. Srovnání nukleotidů s nukleotidy odhalilo slabou podobnost mezi H. influenzae prophage HP2 a identifikovaným prophage. Identifikovaný prophage je proto pro Av jedinečný. paragallinarum. Doporučujeme jej nazvat AvpC-2M-HP2.

dvě další kontigy také obsahovaly geny podobné HP2 (obrázek 3). Další vyšetřování podobnosti mezi identifikovanými contigs (A, B, a C AcpC-2M-HP2) je uvedeno, že tři contigs sdílet stejné genomické organizaci, ale nejsou totožné.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Obrázek 3

HP2-jako prophage genetické zastoupení. V tomto diagramu jsou znázorněny různé kontigy (a), (b) A (c) nesoucí otevřené čtecí rámce podobné HP2. V genomu Av byl identifikován kompletní HP2 podobný prophage AvpC-2M-HP2. paragallinarum Modesto reprezentovaný (c) v tomto diagramu.

hojnost jiných prophage geny byly identifikovány také, ale nemůže být přiřazen k žádné konkrétní nemoci nebo fágových rodiny.

mapování všech odhalených genů prophage nám tedy umožnilo navrhnout dvě proroctví v Av. paragallinarum. Jeden prophage, AvpmyC-2M, připomíná mu-like prophage, zatímco druhý prophage, AvpC-2M-HP2, připomíná HP2 prophage h. influenzae.

Konflikt Zájmů,

autoři prohlašují, že žádný střet zájmů s některou z komerčních identity uvedeno v novinách.

Potvrzení

autoři by rádi poděkovali JCVI pro poskytování JCVI Anotace Služba, která jim poskytla automatické anotace dat a ruční anotace nástroj Manatee.