rezumat

secvențierea întregului genom bacterian a furnizat o abundență de secvențe de profage ca produs secundar, iar analiza acestor secvențe a relevat modalități prin care fagii au afectat genomul bacteriilor gazdă la diferite specii bacteriene. Scopul acestui studiu a fost identificarea secvențelor legate de fag în proiectul de asamblare a genomului Avibacterium paragallinarum, agentul cauzal al corizei infecțioase la păsările de curte. Ansamblul genomului întreg nu a fost posibil datorită prezenței golurilor și/sau repetițiilor existente la capetele contigilor. Cu toate acestea, adnotarea genomului a dezvăluit secvențe de rămășițe profage și profage prezente în acest genom. Din rezultatele obținute, s-a putut identifica un bacteriofag complet asemănător Mu, denumit AvpmuC-2m. a fost identificată și o secvență completă de bacteriofag asemănător HP2, numit AvpC-2m-HP2.

1. Bacteriofagii au fost descoperiți pentru prima dată în Anglia, 1915, de Frederick W. Twort și independent de acesta în 1917 de Felix d ‘ Herelle la Institutul Pasteur din Paris . Bacteriofagii sunt viruși care infectează bacteriile și pot fi împărțiți în două grupuri în funcție de mijloacele lor de interacțiune cu celula bacteriană, și anume, fagi litici (virulenți) și temperați (lizogeni). Fagii litici continuă de obicei cu replicarea în momentul după infectarea celulei gazdă, unde un număr mare de viruși noi sunt eliberați prin liza celulei gazdă. Fagii temperați nu încep neapărat replicarea imediat după infecție și, în funcție de o serie de condiții, acești fagi își pot integra cromozomul în genomul celulei gazdă, rămânând astfel tăcuți până la Indus . Odată ce un genom bacteriofag este integrat în genomul celulei gazdă, acesta este denumit profag. Profagii sunt principalii suspecți în cazul adaptării agenților patogeni existenți la gazde noi sau apariția de noi agenți patogeni sau clone epidemice . Bacteriile nu au un ciclu de viață sexuală, iar schimbul de alele în cadrul unei populații este îndeplinit prin transfer orizontal de gene, iar sursa acestui ADN poate fi fagii, printre altele . Cu excepția cazului în care este restricționat de bariera speciilor, unități funcționale întregi pot fi importate din aceste surse, iar ADN-ul transferat poate varia de la 1 kb la mai mult de 100 kb și poate codifica structuri complexe de suprafață sau chiar căi metabolice întregi . De mult timp sa stabilit că bacteriofagii contribuie la patogenitatea gazdelor lor bacteriene, deoarece multe gene s-au dovedit a fi transferate între bacterii prin fagi . Aceste gene pot codifica un subset divers de factori de virulență, cum ar fi toxina, factorii de reglementare (care reglează în sus expresia genelor de virulență gazdă) și enzimele, care pot modifica componentele de virulență bacteriană .

secvențierea întregului genom bacterian a furnizat o abundență de secvențe de profage . Profagii pot constitui până la 10-20% din genomul unei bacterii, deși multe dintre aceste profagii sunt criptice și se află într-o stare de degradare mutațională . Analiza acestor secvențe a relevat numeroase moduri în care profagii modelează genomul bacteriilor gazdă . Profagii au capacitatea de a-și afecta arhitectura genomului gazdă prin schimbarea conținutului genomului, prin modificarea organizării genomului sau prin modificarea locației și a ordinii genelor . Bacteriofagii temperați joacă un rol complicat în generarea diversității microbiene și în evoluția genomurilor bacteriene prin medierea rearanjării în cadrul cromozomului bacterian și, ca urmare, contribuie semnificativ la diferențele de interstrain în cadrul aceleiași specii bacteriene . Prin comparație, două tulpini de Streptococcus pyogenes aparțin serotipurilor m diferite și sunt asociate fără legătură cu diferite boli—dar atunci când aceste tulpini au fost comparate la nivel ADN, diferențele cheie s-au corelat cu secvențele profage . Un alt exemplu poate fi observat în Campylobacter jejuni, unde diferențele de intertrain pot fi atribuite inversiunilor intra-genomice ale secvențelor ADN profage asemănătoare Mu . Comparațiile dintre genomii coliniari au arătat că decalajele dintre genomii relevanți au fost atribuite prezenței secvențelor profage sau ca urmare a genomurilor bacteriene rearanjate . În multe cazuri, profagii cu identitate limitată a secvenței ADN sau profagii duplicate servesc drept puncte de ancorare pentru recombinarea omoloagă . În plus, profagii se pot recombina cu alți profagii care contribuie la structura lor mozaică .

Avibacterium paragallinarum este un agent patogen care vizează puii de găină și cauzează boala coryza infecțioasă . Filogenetic, această bacterie aparține familiei Pasteurellaceae și a fost cunoscută anterior ca Haemophilus paragallinarum redenumită în 2005 . Familia Pasteurellaceae este alcătuită din bacterii strâns legate și în cadrul acestei familii au fost raportate diferiți bacteriofagi în Haemophilus influenzae, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Pasteurella multocida și Mannheimia haemolytica. Secvențe asemănătoare bacteriofagului au fost raportate în Histophilus somni . În această lucrare, descriem rămășițele prophage și prophage detectate în Av. paragallinarum.

2. Materiale și metode

2.1. Tulpini bacteriene și Condiții de creștere

Av. tulpina paragallinarum C-2 (Modesto) a fost obținută din produse biologice Onderstepoort, Onderstepoort, Africa de Sud. Tulpina Modesto este dependentă de NAD+ și a fost cultivată în TM/SN suplimentată cu 1% (v/v) ser de pui, 1% (v/v) nad+ și 0,0005% (m/v) soluție de tiamină și cultivată în condiții de limitare a oxigenului într-un borcan de lumânare la 37 C / V Timp de 16 ore .

2.2. Extragerea ADN-ului

extracția ADN-ului Genomic a fost efectuată cu ajutorul unui mini kit QIAamp ADN de la Qiagen. Recomandările producătorului au fost respectate cu meticulozitate, cu excepția procedurii de eluție în care ADN-ul genomic a fost eluat la 2 x,80 x,10 mm Tris-HCl, pH 8.

2.3. Identificarea Av. paragallinarum

Av. paragallinarum a fost identificat prin utilizarea unui protocol PCR dezvoltat special pentru această bacterie . În plus, regiunea ADN ribozomal 16S (ADNR) a fost amplificată pentru a identifica Av. paragallinarum . Produsul PCR obținut a fost excizat din gelul de agaroză, purificat și secvențiat direct pentru a evita orice posibilă contaminare cu ADN genomic străin.

2.4. Adunarea genomului și adnotarea

probe de ADN Genomic de Av. tulpina paragallinarum C-2 (Modesto) a fost trimisă la Agowa Genomics (acum cunoscută sub numele de LGC Genomics), Germania, pentru pirosecvența de titan GS-FLX. Secvențele / citirile obținute din pirosecvențe au fost asamblate folosind Newbler 2.0.01.14 de la 454 Life Sciences Corporation cu o identitate de potrivire minimă de suprapunere de 90% și o lungime minimă de potrivire de suprapunere de 40 de baze. Secvențele de contiguri obținute au fost trimise la Institutul J. Craig Venter (JCVI) ca pseudomolecule pentru adnotare. Conducta include găsirea genei cu căutări Glimmer, BLAST-Extend-Repraze (BER), căutări ascunse Markov Models (HMM), căutări Trans Membrane ascunse Markov Models (TMHMM), predicții SignalP și adnotări automate de la AutoAnnotate. Toate aceste informații sunt stocate într-o bază de date MySQL și fișierele asociate care au fost descărcate pe site-ul nostru. Instrumentul Manual de adnotare Manatee a fost descărcat de la SourceForge (http://manatee.sourceforge.net/) și utilizat pentru a revizui manual ieșirea din conductă. pDraw32 de la ACACLONE software-ul a fost folosit pentru a desena hărți genetice pentru regiunea prophage.

2.5. Numere de aderare

AvpmuC-2m (aderare nr.: JN627905); HP-2 cum ar fi prophages contig a (JN627906), B (JN627907) și C (JN627908); fragmente de profage lamboid (număr de aderare: JN627909-JN627919); gene de integrază profage (număr de aderare: JN627920-JN627928).

3. Rezultate și discuții

întregul proiect de secvențiere a genomului Av. paragallinarum a dat un număr total de 160 743 de lecturi/secvențe prin chimia pirosecvențelor. Numărul total de contiguri asamblate din aceste secvențe a fost de 300, cea mai mare contig cuprinzând 78 465 bp, iar dimensiunea medie contig mai mare de 500 bp a fost de 10 727 bp. Un genom închis nu a putut fi asamblat pentru Av. paragallinarum din rezultatele secvențierii obținute datorită secvențelor repetate care au existat la capătul(capetele) contigilor sau ca urmare a decalajelor de secvență dintre contiguri. O moleculă de pseudogenom a fost asamblată din cele 300 de contiguri obținute și a fost trimisă la JCVI pentru adnotarea genomului. Rezultatele adnotării au indicat că un total de 7% sau 141 de cadre de citire deschise au fost atribuite funcțiilor proteinei fagului. Cele 141 de cadre de citire deschise au fost identificate pe 60 din cele 300 de contiguri în care au fost cartografiate una sau o serie de gene profage. Nouă gene de integrază prophage au fost identificate și mapate la șapte din cele 60 de contiguri. Investigațiile asupra cadrelor de citire deschise adiacente integrazelor identificate nu au evidențiat gene suplimentare legate de profage, ci mai degrabă gene care codifică proteinele membranei; proteine metabolice; proteine ribozomale; proteinele funcției membranei celulare sau proteinele de export ale membranei. Nu s-a observat o omologie semnificativă între integraze.

genele profage asemănătoare Mu au fost identificate și mapate la 11 contiguri diferite. Cele 11 contiguri au fost comparate cu harta genomului Fagilor asemănători Mu raportată de . Aici vă sugerăm o profeție presupusă de Mu pentru Av. paragallinarum, AvpmuC-2m (Figura 1). O mare parte din gena Mu (25) a fost identificată pe un singur contig cuprinzând 27, 107 bp. Două contiguri suplimentare au fost identificate completând harta unui profage asemănător Mu pentru Av. paragallinarum.

Figura 1

reprezentarea genomului presupusă a AvpmuC-2m. cele trei contiguri care au fost utilizate în construcția AvpmuC-2M sunt separate de//. Dimensiunile Contig sunt indicate sub fiecare contig în perechi de baze.

patruzeci și unu de gene lamboide au fost mapate la 11 contiguri diferite (Figura 2). Cu datele disponibile din întregul proiect de secvențiere a genomului, nu s-a putut concluziona dacă profagia lamboidă este completă sau dacă a suferit o pierdere masivă de ADN funcțional care a dus la fragmentarea genomului bacteriofag și, în cele din urmă, a dus la dispariția sa .

Figura 2

reprezentare genetică Lamboidă. Diferite gene lambda au fost mapate la contigii din care au fost identificați și grupați în funcție de funcțiile asociate . Începuturile și capetele contigilor sunt indicate de //.

un lizogen complet al unui fag temperat a fost identificat pe un singur contig din genom. Succesiunea genelor identificate este similară cu cea a H. influenzae HP2 prophage. O comparație nucleotidă-nucleotidă a relevat o asemănare slabă între H. influenzae prophage HP2 și prophage identificat. Prophage identificat este, prin urmare, unic pentru Av. paragallinarum. Vă sugerăm să o numiți AvpC-2m-HP2.

două contiguri suplimentare conțineau, de asemenea, gene asemănătoare HP2 (Figura 3). Investigații suplimentare privind similitudinea dintre contigii identificați (A, B și C ale AcpC-2m-HP2) au indicat faptul că cei trei contigi împărtășesc aceeași organizare genomică, dar nu sunt identici.

(a)

(B)

(c)

(A)
(B)
(c)

figura 3

reprezentarea genetică a prophage asemănătoare HP2. Diferitele contiguri (A), (b) și (c) care poartă cadre de citire deschise asemănătoare HP2 sunt ilustrate în această diagramă. Un complet HP2-like prophage AvpC-2M-HP2 a fost identificat în cadrul genomului Av. paragallinarum Modesto reprezentat de (c) în această diagramă.

o abundenta de alte gene prophage au fost, de asemenea, identificate, dar nu au putut fi atribuite la orice fag specifice sau familie de fagi.

astfel, cartografierea tuturor genelor profage descoperite ne-a permis să sugerăm două profage în Av. paragallinarum. Un prophage, AvpmyC-2m, seamănă cu un prophage asemănător Mu, în timp ce celălalt prophage, AvpC-2m-HP2, seamănă cu HP2 prophage de H. influenzae.

Conflict de interese

autorii declară că nu există niciun conflict de interese cu niciuna dintre identitățile comerciale menționate în lucrare.

confirmare

autorii ar dori să mulțumească JCVI pentru furnizarea serviciului de adnotare JCVI care le-a furnizat date automate de adnotare și Instrumentul manual de adnotare Manatee.