Identificazione di Prophages e Profago Resti all’interno del Genoma di Avibacterium paragallinarum Batterio
Abstract
Batterica il sequenziamento dell’intero genoma ha consegnato un’abbondanza di profago sequenze come prodotto e l’analisi di queste sequenze ha rivelato modi in cui fagi hanno interessato il genoma dei loro batteri ospite in diverse specie batteriche. Lo scopo di questo studio era identificare le sequenze correlate ai fagi nel progetto di assemblaggio del genoma di Avibacterium paragallinarum, l’agente eziologico della corizza infettiva nel pollame. L’intero assemblaggio del genoma non è stato possibile a causa della presenza di lacune e/o ripetizioni esistenti sulle estremità dei contig. Tuttavia, annotazione genoma rivelato prophage e prophage residuo sequenze presenti in questo genoma. Dai risultati ottenuti, è stato possibile identificare un batteriofago completo simile a Mu che è stato definito AvpmuC-2M. È stata anche identificata una sequenza completa di batteriofago simile a HP2, denominato AvpC-2M-HP2.
1. Introduzione
I batteriofagi furono scoperti per la prima volta in Inghilterra, nel 1915, da Frederick W. Twort e indipendentemente da ciò nel 1917 da Felix d’Herelle presso l’Istituto Pasteur di Parigi . I batteriofagi sono virus che infettano i batteri e possono essere suddivisi in due gruppi in base ai loro mezzi di interazione con la cellula batterica, vale a dire i fagi litici (virulenti) e temperati (lisogenici). I fagi litici procedono tipicamente con la replica il momento dopo l’infezione della cellula ospite, in cui un gran numero di nuovi virus viene rilasciato attraverso la lisi della cellula ospite. I fagi temperati non iniziano necessariamente la replicazione immediatamente dopo l’infezione e, a seconda di una serie di condizioni, questi fagi possono integrare il loro cromosoma nel genoma della cellula ospite rimanendo così silenziosi fino all’induzione . Una volta che un genoma del batteriofago è integrato nel genoma della cellula ospite si riferisce a come un prophage. I profagi sono i principali sospetti nell’evento di adattamento degli agenti patogeni esistenti a nuovi ospiti o all’emergere di nuovi agenti patogeni o cloni epidemici . I batteri non hanno ciclo di vita sessuale e lo scambio di alleli all’interno di una popolazione è soddisfatta tramite trasferimento genico orizzontale, e la fonte di questo DNA può essere fagi, tra gli altri . A meno che non sia limitato dalla barriera di specie, intere unità funzionali possono essere importate da queste fonti e il DNA trasferito può variare da 1 kb a più di 100 kb di dimensione e può codificare strutture superficiali complesse o anche intere vie metaboliche . È stato a lungo stabilito che i batteriofagi contribuiscono alla patogenicità dei loro ospiti batterici poiché molti geni hanno dimostrato di subire il trasferimento tra i batteri attraverso i fagi . Questi geni possono codificare un sottoinsieme diverso di fattori di virulenza come la tossina, i fattori regolatori (che regolano l’espressione dei geni di virulenza ospite) e gli enzimi, che possono alterare i componenti della virulenza batterica .
Il sequenziamento batterico dell’intero genoma ha fornito un’abbondanza di sequenze di prophage . I profagi possono costituire fino al 10-20% del genoma di un batterio, anche se molti di questi profagi sono criptici e in uno stato di decadimento mutazionale . L’analisi di queste sequenze ha rivelato numerosi modi in cui i profagi modellano il genoma dei loro batteri ospiti . I profagi hanno la capacità di influenzare la loro architettura del genoma ospite modificando il contenuto del genoma, modificando l’organizzazione del genoma o alterando la posizione e l’ordine dei geni . I batteriofagi temperati svolgono un ruolo intricato nella generazione della diversità microbica e nell’evoluzione dei genomi batterici attraverso la mediazione del riarrangiamento all’interno del cromosoma batterico e di conseguenza contribuiscono in modo significativo alle differenze interstellari all’interno della stessa specie batterica . In confronto, due ceppi di Streptococcus pyogenes appartengono a diversi sierotipi M e sono non collegati a diverse malattie – ma quando questi ceppi sono stati confrontati a livello di DNA, le differenze chiave sono correlate alle sequenze di prophage . Un altro esempio può essere osservato all’interno di Campylobacter jejuni, dove le differenze interstellari possono essere attribuite verso inversioni intra-genomiche di sequenze di DNA profagico simili a Mu . I confronti tra genomi colineari hanno mostrato che gli spazi tra i genomi rilevanti sono stati attribuiti alla presenza di sequenze di prophage o come risultato di genomi batterici riorganizzati . In molti casi i profagi con un’identità di sequenza del DNA limitata o i profagi duplicati servono come punti di ancoraggio per la ricombinazione omologa . Inoltre i profagi possono ricombinarsi con altri profagi che contribuiscono alla loro struttura a mosaico .
Avibacterium paragallinarum è un agente patogeno che colpisce i polli e causa la corizza infettiva della malattia . Filogeneticamente questo batterio appartiene alla famiglia Pasteurellaceae ed era precedentemente noto come Haemophilus paragallinarum rinominato nel 2005 . La famiglia Pasteurellaceae è composta da batteri strettamente correlati e all’interno di questa famiglia, vari batteriofagi sono stati segnalati in Haemophilus influenzae, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Pasteurella multocida e Mannheimia haemolytica. Sequenze batteriofagi-simili sono state riportate in Histophilus somni . In questo articolo, descriviamo prophage e prophage resti rilevati in Av. paragallinarum.
2. Materiali e metodi
2.1. Ceppi batterici e condizioni di crescita
Av. paragallinarum ceppo C-2 (Modesto) è stato ottenuto da Onderstepoort Biological Products, Onderstepoort, Sud Africa. Ceppo Modesto è NAD + dipendente ed è stato coltivato in TM / SN integrato con 1% (v/v) siero di pollo, 1% (v/v) NAD+, e 0.0005% (m / v) soluzione di tiamina e coltivato in condizioni limitanti di ossigeno in un barattolo di candela a 37°C per 16 h .
2.2. Estrazione del DNA
L’estrazione del DNA genomico è stata eseguita con l’uso di un QIAamp DNA Mini kit di Qiagen. Le raccomandazioni del produttore sono state meticolosamente seguite tranne che per la procedura di eluizione in cui il DNA genomico è stato eluito in 2 × 80 µL 10 mm Tris-HCl, pH 8.
2.3. Identificazione di Av. paragallinarum
Av. paragallinarum è stato identificato utilizzando un protocollo PCR sviluppato specificamente per questo batterio . Inoltre, la regione del DNA ribosomiale 16S (rDNA) è stata amplificata per identificare Av. paragallinarum . Il prodotto PCR ottenuto è stato asportato dal gel di agarosio, purificato e sequenziato direttamente per evitare qualsiasi possibile contaminazione del DNA genomico estraneo.
2.4. Assemblaggio del genoma e annotazione
Campioni di DNA genomico di Av. paragallinarum ceppo C-2 (Modesto) sono stati inviati a Agowa Genomics (ora noto come LGC Genomics), Germania, per GS-FLX Titanium pyrosequencing. Sequenze / letture ottenute dal pyrosequencing sono state assemblate utilizzando Newbler 2.0.01.14 da 454 Life Sciences Corporation con un’identità di corrispondenza minima di sovrapposizione del 90% e una lunghezza minima di corrispondenza di sovrapposizione di 40 basi. Le sequenze di contig ottenuti sono state presentate al J. Craig Venter Institute (JCVI) come pseudomolecola per l’annotazione. La pipeline include gene finding con Glimmer , BLAST-Extend-Repraze (BER) ricerche , modelli di Markov nascosti (HMM) ricerche , Trans membrana nascosta modelli di Markov (TMHMM) ricerche , previsioni SignalP, e annotazioni automatiche da AutoAnnotate. Tutte queste informazioni sono memorizzate in un database MySQL e file associati che è stato scaricato sul nostro sito. Lo strumento di annotazione manuale Lamantino è stato scaricato da SourceForge (http://manatee.sourceforge.net/) e utilizzato per rivedere manualmente l’output dalla pipeline. pDraw32 dal software ACACLONE è stato utilizzato per disegnare mappe genetiche per la regione prophage.
2.5. Numeri di adesione
AvpmuC-2M (numero di adesione: JN627905); HP – 2 come prophages contig A (JN627906), B (JN627907) e C (JN627908); lamboid prophage fragments (accession nos.: JN627909-JN627919); prophage integrase genes (accession nos.: JN627920-JN627928).
3. Risultati e discussione
L’intero progetto di sequenziamento del genoma di Av. paragallinarum ha prodotto un numero totale di 160 743 letture/sequenze attraverso la chimica di pyrosequencing. Il numero totale di contig assemblati da queste sequenze era 300 con il più grande contig comprendente 78 465 bp e la dimensione media contig più lungo di 500 bp erano 10 727 bp. Un genoma chiuso non può essere assemblato per Av. paragallinarum dai risultati di sequenziamento ottenuti a causa di sequenze ripetute che esistevano alle estremità dei contig o come risultato di intervalli di sequenza tra contig. Una molecola di pseudogenoma è stata assemblata dai 300 contig ottenuti ed è stata inviata al JCVI per l’annotazione del genoma. I risultati dell’annotazione hanno indicato che un totale di 7% o 141 fotogrammi di lettura aperti sono stati assegnati alle funzioni della proteina fago. I 141 fotogrammi di lettura aperti sono stati identificati su 60 dei 300 contigui in cui sono stati mappati uno o una serie di geni di prophage. Nove geni dell’integrasi di prophage sono stati identificati e mappati su sette dei 60 contig. Le indagini su fotogrammi di lettura aperti adiacenti alle integrasi identificate non hanno rivelato ulteriori geni correlati alla prophage, ma piuttosto geni che codificano proteine di membrana; proteine metaboliche; proteine ribosomiali; proteine di funzione della membrana cellulare o proteine di esportazione della membrana. Non è stata osservata alcuna omologia significativa tra le integrasi.
I geni profagici simili a Mu sono stati identificati e mappati su 11 diversi contig. Gli 11 contig sono stati confrontati con la mappa del genoma di fagi simili a Mu riportati da . Qui suggeriamo una prophage Mu-like putativo per Av. paragallinarum, AvpmuC – 2M (Figura 1). Una grande porzione del gene Mu (25) è stata identificata su un singolo contig comprendente 27.107 bp. Due contig sono stati identificati completando la mappa di un Mu-come prophage per Av. paragallinarum.
Quarantuno geni lamboidi sono stati mappati su 11 diversi contig (Figura 2). Con i dati disponibili dall’intero progetto di sequenziamento del genoma non è stato possibile concludere se la prophage lamboid è completa o se ha subito una massiccia perdita di DNA funzionale con conseguente frammentazione del genoma del batteriofago e, infine, che porta alla sua scomparsa .
Un lisogeno completo di un fago temperato è stato identificato su un singolo contig all’interno del genoma. La successione dei geni identificati è simile a quella di H. influenzae HP2 prophage. Un confronto da nucleotide a nucleotide ha rivelato una debole somiglianza tra il profago H. influenzae HP2 e il profago identificato. Il profago identificato è quindi unico per Av. paragallinarum. Si consiglia di chiamarlo AvpC-2M-HP2.
Due contigui aggiuntivi contenevano anche geni simili a HP2 (Figura 3). Ulteriori indagini sulla somiglianza tra i contig identificati (A, B e C di AcpC-2M-HP2) hanno indicato che i tre contig condividono la stessa organizzazione genomica ma non sono identici.
a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
HP2-come profago genetica rappresentazione. I vari contigui (a), (b) e (c) che trasportano cornici di lettura aperte simili a HP2 sono illustrati all’interno di questo diagramma. Un completo HP2-come prophage AvpC-2M-HP2 è stato identificato all’interno del genoma di Av. paragallinarum Modesto rappresentato da (c) in questo diagramma.
È stata anche identificata un’abbondanza di altri geni profagici, ma non è stato possibile assegnarli a nessun fago o famiglia di fagi specifici.
Quindi la mappatura di tutti i geni profagici scoperti ci ha permesso di suggerire due profagie in Av. paragallinarum. Una profezia, AvpmyC-2M, assomiglia a una profezia simile a Mu, mentre l’altra profezia, AvpC-2M-HP2, assomiglia alla profezia HP2 di H. influenzae.
Conflitto di interessi
Gli autori dichiarano che non esiste alcun conflitto di interessi con nessuna delle identità commerciali menzionate all’interno del documento.
Riconoscimento
Gli autori desiderano ringraziare JCVI per aver fornito il servizio di annotazione JCVI che ha fornito loro i dati di annotazione automatica e lo strumento di annotazione manuale Manatee.