absztrakt

a bakteriális teljes genom szekvenálása melléktermékként rengeteg profág szekvenciát eredményezett, és ezeknek a szekvenciáknak az elemzése feltárta, hogy a fágok milyen módon befolyásolták a gazdabaktériumok genomját különböző baktériumfajokban. Ennek a tanulmánynak az volt a célja, hogy azonosítsa a fághoz kapcsolódó szekvenciákat az Avibacterium paragallinarum Genom tervezetében, amely a baromfi fertőző coryza kórokozója. A teljes genom összeszerelése nem volt lehetséges a rések és/vagy ismétlődések jelenléte miatt. A genom annotációja azonban feltárta a genomban jelen lévő profág és profág maradék szekvenciákat. A kapott eredmények alapján egy teljes mu-szerű bakteriofág azonosítható, amelyet AvpmuC-2m-nek neveztek. a HP2-szerű bakteriofág teljes szekvenciáját, az AvpC-2m-HP2 nevet is azonosították.

1. Bevezetés

a bakteriofágokat először Angliában fedezték fel, 1915-ben, Frederick W. 1917-ben Felix d ‘ Herelle a párizsi Pasteur Intézetben . A bakteriofágok olyan vírusok, amelyek megfertőzik a baktériumokat, és két csoportra oszthatók a baktériumsejtekkel való kölcsönhatásuk módja szerint, nevezetesen litikus (virulens) és mérsékelt (lizogén) fágok. A litikus fágok jellemzően a replikációval járnak a gazdasejt megfertőzését követő pillanatban, ahol nagyszámú új vírus szabadul fel a gazdasejt lízisén keresztül. A mérsékelt fágok nem feltétlenül kezdik meg a replikációt közvetlenül a fertőzés után, és számos körülménytől függően ezek a fágok integrálhatják kromoszómájukat a gazdasejt genomjába, így csendben maradnak, amíg indukálják . Miután egy bakteriofág genomot integráltak a gazdasejt genomjába, azt profágnak nevezik. A próféták az elsődleges gyanúsítottak a meglévő kórokozók új gazdaszervezetekhez való alkalmazkodási eseményében, vagy új kórokozók vagy járványos klónok megjelenésében . A baktériumoknak nincs szexuális életciklusa, és a populáción belüli allélcsere horizontális géntranszfer révén valósul meg, és ennek a DNS-nek a forrása többek között fágok lehetnek . Hacsak nem korlátozza a fajhatár, teljes funkcionális egységek importálhatók ezekből a forrásokból, és az átvitt DNS mérete 1 kb-tól több mint 100 kb-ig terjedhet, és összetett felületi struktúrákat vagy akár teljes anyagcsere-útvonalakat is kódolhat . Régóta megállapították, hogy a bakteriofágok hozzájárulnak bakteriális gazdaszervezeteik patogenitásához, mivel kimutatták, hogy sok gén átkerül a baktériumok között a fágokon keresztül . Ezek a gének a virulencia faktorok különböző részhalmazát kódolhatják, mint például a toxint, a szabályozó tényezőket (amelyek a gazdaszervezet virulencia génjeinek expresszióját szabályozzák) és az enzimeket, amelyek megváltoztathatják a bakteriális virulencia komponenseket .

a bakteriális teljes genom szekvenálása rengeteg profágszekvenciát eredményezett . A próféták a baktérium genomjának akár 10-20% – át is alkothatják, bár ezek közül a próféták közül sok rejtélyes és mutációs bomlási állapotban van . Ezeknek a szekvenciáknak az elemzése számos módot tárt fel arra, hogy a profágok hogyan formálják gazdabaktériumaik genomját . A profágok képesek befolyásolni a gazda Genom architektúráját a genom tartalmának megváltoztatásával, a genom szerveződésének módosításával vagy a gének helyének és sorrendjének megváltoztatásával . A mérsékelt égövi bakteriofágok bonyolult szerepet játszanak a mikrobiális sokféleség kialakulásában és a bakteriális genomok evolúciójában a bakteriális kromoszómán belüli átrendeződés közvetítésével, és ennek eredményeként jelentősen hozzájárulnak az ugyanazon baktériumfajon belüli interstrain különbségekhez . Összehasonlításképpen, két Streptococcus pyogenes törzs különböző M szerotípusokhoz tartozik, és nem kapcsolódnak egymáshoz különböző betegségekkel—de amikor ezeket a törzseket DNS szinten hasonlították össze, a legfontosabb különbségek korreláltak a profág szekvenciákkal . Egy másik példa figyelhető meg a Campylobacter jejuni-n belül, ahol az interstrain különbségek a MU-szerű profág DNS-szekvenciák intra-genomiális inverzióinak tulajdoníthatók . A kolineáris genomok közötti összehasonlítások azt mutatták, hogy a releváns genomok közötti réseket a profágszekvenciák jelenlétének vagy az átrendezett bakteriális genomok eredményeként tulajdonították . Sok esetben a korlátozott DNS-szekvencia-identitású vagy duplikált profágok szolgálnak a homológ rekombináció rögzítési pontjaiként . Ezenkívül a próféták rekombinálódhatnak más prófétákkal, amelyek hozzájárulnak mozaikszerkezetükhöz .

az Avibacterium paragallinarum egy csirkéket célzó kórokozó, amely a fertőző coryza betegséget okozza . Filogenetikailag ez a baktérium a Pasteurellaceae családba tartozik, korábban Haemophilus paragallinarum néven ismert, 2005-ben átnevezték . A Pasteurellaceae családot közeli rokon baktériumok alkotják, és ezen a családon belül különböző bakteriofágokról számoltak be a Haemophilus influenzae, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Pasteurella multocida és Mannheimia haemolytica fajokban. Bakteriofágszerű szekvenciákat jelentettek a Histophilus somni-ban . Ebben a tanulmányban leírjuk az Av-ben észlelt profágokat és profág maradványokat. paragallinarum.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Baktériumtörzsek és növekedési feltételek

Av. a paragallinarum C-2 törzset (Modesto) Onderstepoort biológiai termékekből nyerték, Onderstepoort, Dél-Afrika. A Modesto törzs NAD + – függő, és TM/SN-ben tenyésztették, kiegészítve 1% (v/v) csirkeszérummal, 1% (v/v) nad+ – val és 0,0005% (m/v) tiaminoldattal, és oxigénkorlátozó körülmények között egy gyertyatartó üvegben termesztették 37cc-n 16 órán át .

2.2. DNS-extrakció

a genomi DNS-extrakciót a Qiagen QIAamp DNS Mini készletével végeztük. A gyártó ajánlásait aprólékosan betartották, kivéve az elúciós eljárást, ahol a genomi DNS-t eluáltuk 2 60 60 mm-es Tris-HCl-ben, pH 8-ban.

2.3. Az Av azonosítása. paragallinarum

Av. a paragallinarumot kifejezetten erre a baktériumra kifejlesztett PCR protokoll alkalmazásával azonosították . Ezenkívül a 16S riboszomális DNS (rDNS) régiót amplifikáltuk az Av azonosítása érdekében. paragallinarum . A kapott PCR-terméket kivágtuk az agarózgélből, tisztítottuk, és közvetlenül szekvenáltuk, hogy elkerüljük az esetleges idegen genomiális DNS-szennyeződést.

2.4. Genom összeállítás és annotáció

genomi DNS minták Av. paragallinarum törzs C-2 (Modesto) küldtek Agowa Genomics (ma ismert, mint LGC Genomics), Németország, a GS-FLX titán piroszekvenálás. A piroszekvenálásból nyert szekvenciákat/leolvasásokat a Newbler 2.0.01.14 segítségével állítottuk össze a 454 Life Sciences Corporation-től, az átfedés minimális egyezési identitása 90%, az átfedés minimális egyezési hossza pedig 40 bázis. A kapott összefüggések szekvenciáit a J. Craig Venter Intézet (JCVI) mint a pszeudomolekula kommentárhoz. A csővezeték magában foglalja a Génkeresést Glimmer , BLAST-Extend-Repraze (BER) keresésekkel , rejtett Markov modellek (Hmm) keresésekkel , transzmembrán rejtett Markov modellek (Tmhmm) keresésekkel , SignalP jóslatokkal és automatikus kommentárokkal AutoAnnotate. Mindezeket az információkat egy MySQL adatbázisban tároljuk, és a kapcsolódó fájlokat, amelyeket letöltöttünk a webhelyünkre. A Manatee kézi annotációs eszközt letöltötték a SourceForge – ból (http://manatee.sourceforge.net/), és a folyamat kimenetének kézi áttekintésére használták. pDraw32 az ACACLONE szoftverből genetikai térképek készítésére használták a prophage régió számára.

2, 5. Csatlakozási számok

AvpmuC-2m (csatlakozási szám.: JN627905); HP-2, mint a profágok contig A (JN627906), B (JN627907) és C (JN627908); lamboid profág fragmentumok (csatlakozási szám: JN627909-JN627919); profág integráz gének (csatlakozási szám: JN627920-JN627928).

3. Eredmények és megbeszélés

Az Av teljes genomszekvenálási projektje. a paragallinarum összesen 160 743 olvasást/szekvenciát eredményezett a piroszekvenálási kémia révén. Az ezekből a szekvenciákból összeállított összes Contig 300 volt, a legnagyobb contig 78 465 bp-t tartalmazott, az 500 bp-nél hosszabb átlagos contig-méret pedig 10 727 bp volt. Zárt genomot nem lehetett összeállítani az Av számára. paragallinarum a szekvenálási eredményekből, amelyek a folytonos vég(ek) en létező ismétlődő szekvenciák vagy a folytonos szekvenciahézagok eredményeként jöttek létre. A kapott 300 érintkezőből egy pszeudogenom molekulát állítottunk össze, amelyet elküldtünk a jcvi-nek Genom annotáció céljából. Az annotációs eredmények azt mutatták, hogy összesen 7% vagy 141 nyitott olvasási keretet rendeltek a fágfehérje funkciókhoz. A 141 nyitott olvasási keretet 60-on azonosították a 300-ból contigs ahol egy vagy egy sor profággént térképeztek fel. Kilenc prophage integráz gént azonosítottak és leképeztek a 60 kapcsolat közül hétre. Az azonosított integrázokkal szomszédos nyílt leolvasási keretek vizsgálata nem tárt fel további profágokkal kapcsolatos géneket, hanem inkább membránfehérjéket kódoló géneket; metabolikus fehérjék; riboszomális fehérjék; sejtmembrán funkció fehérjék, vagy membrán export fehérjék. Az integrázok között nem figyeltek meg szignifikáns homológiát.

Mu-szerű profág géneket azonosítottak és feltérképeztek 11 különböző kapcsolatban. A 11 contigs összehasonlítottuk a genom térképe Mu-szerű fágok által jelentett . Itt javasolunk egy feltételezett mu-szerű prófétát az Av számára. paragallinarum, AvpmuC-2m (1.ábra). A Mu gén (25) nagy részét egyetlen, 27 107 bp-t tartalmazó contig-en azonosítottuk. Két további összefüggést azonosítottak az AV Mu-szerű prófétájának térképének kitöltésével. paragallinarum.

1. ábra

Az AvpmuC-2m feltételezett genomképe.az AvpmuC-2m felépítéséhez használt három kapcsolatot //választja el. A Contig méretek az egyes contig alatt vannak feltüntetve bázispárokban.

negyvenegy lamboid gént térképeztünk fel 11 különböző összefüggésre (2.ábra). A teljes genomszekvenálási projektből rendelkezésre álló adatok alapján nem lehetett megállapítani, hogy a lamboid profág teljes-e, vagy a funkcionális DNS hatalmas veszteségén ment keresztül, ami bakteriofág Genom fragmentációjához vezetett, és végül eltűnéséhez vezetett .

2.ábra

Lamboid genetikai reprezentáció. Különböző lambda géneket térképeztek fel azokra a kapcsolatokra, amelyekből azonosították őket, és a kapcsolódó funkciók szerint csoportosították őket . A kapcsolatok kezdetét és végét a / / jelöli.

a mérsékelt fág teljes lizogénjét a genomban egyetlen contig-on azonosították. Az azonosított gének egymásutánja hasonló a H. influenzae HP2 prophage-hoz. A nukleotid-nukleotid összehasonlítás gyenge hasonlóságot mutatott a H. influenzae HP2 és az azonosított profág között. Az azonosított profág tehát egyedülálló az Av számára. paragallinarum. Javasoljuk, hogy AvpC-2m-HP2-nek nevezzük.

két további kontig is tartalmazott HP2-szerű géneket (3.ábra). Az ACPC-2m-HP2 azonosított kontigjai (A, B és C) közötti hasonlóság további vizsgálata azt mutatta, hogy a három kontig azonos genomi szerveződéssel rendelkezik, de nem azonosak.

(a)

(b)

(C)

(a)
(b)
(C)

3.ábra

HP2-szerű profág genetikai reprezentáció. A HP2-szerű nyitott olvasókereteket hordozó különböző (a), (b) és (c) összefüggéseket ebben a diagramban mutatjuk be. Egy teljes HP2-szerű avpc-2m-HP2 profágot azonosítottak az Av genomjában. paragallinarum Modesto képviseli (c) Ebben a diagramban.

rengeteg más profággént is azonosítottak, de nem lehetett hozzárendelni semmilyen specifikus fághoz vagy fágcsaládhoz.

így az összes feltárt profág gén feltérképezése lehetővé tette számunkra, hogy két profágot javasoljunk az Av-ben. paragallinarum. Az egyik profág, az AvpmyC-2m, hasonlít egy Mu-szerű profágra, míg a másik profág, az AvpC-2m-HP2, hasonlít a H. influenzae HP2 profágjára.

összeférhetetlenség

a szerzők kijelentik, hogy a cikkben említett kereskedelmi identitások egyikével sem áll fenn összeférhetetlenség.

elismerés

a szerzők szeretnék megköszönni a jcvi-nek a JCVI annotációs Szolgáltatás nyújtását, amely automatikus annotációs adatokat és a Manatee kézi annotációs eszközt biztosított számukra.