a genomszekvenálási projektek befejezésének fokozódó üteme megnövelte a nagy áteresztőképességű módszerek szükségességét a génexpresszió szabályozására. Az egyik lehetséges megközelítés az antiszensz oligonukleotidok alkalmazása az mRNS megkötésére és a fehérjeszintézis megelőzésére. Elméletileg ez a stratégia lehetővé teszi a gyors haladást az oligomerek szintézisétől a fenotípus megfigyeléséig . A gyakorlatban az antiszensz technológiát a nem specifikus kölcsönhatásokra való hajlam sújtotta, és ezek lelassították széles körű alkalmazását a biológiai vizsgálatokban . Az utóbbi időben azonban az oligonukleotidok kémiai tulajdonságainak javulása és hatásmechanizmusuk megértése együttesen valószínűbbé tette sikeres felhasználásukat. Számos laboratórium munkája azt sugallja, hogy a morfolino oligonukleotidok mikroinjektálhatók zebrahal, tengeri sün vagy Xenopus embriókba, ahol blokkolják a génexpressziót és fenotípusos hatást fejtenek ki a fejlődés korai szakaszában.

a Morfolino oligonukleotidok nemionos DNS-analógok, amelyek a Gene Tools LLC-től kaphatók . Megváltozott gerinckapcsolatokkal rendelkeznek a DNS-hez vagy az RNS-hez képest (ábra (ábra) 1).1). Megváltozott gerincük ellenére a morfolinók Watson-Crick bázispárosítással kötődnek a komplementer nukleinsavszekvenciákhoz. Ez a kötés nem szorosabb, mint az analóg DNS és RNS oligomerek kötődése, ami viszonylag hosszú, 25 bázisú morfolinók alkalmazását teszi szükségessé az antiszensz gén gátlásához. A gerinc a morfolinókat ellenállóvá teszi a nukleázok általi emésztéssel szemben. Továbbá, mivel a gerincnek nincs negatív töltése, úgy gondolják, hogy a morfolinók kevésbé valószínű, hogy nem szelektíven kölcsönhatásba lépnek a sejtfehérjékkel; az ilyen kölcsönhatások gyakran elhomályosítják az informatív fenotípusok megfigyelését. A morpholinos erősségeit, mint a gerinces fejlődés vizsgálatának eszközeit, jól leírja az Ekker nemrégiben készült áttekintése . Legnagyobb előnyük, hogy a fenotípusok viszonylag olcsó módszerrel gyorsan megfigyelhetők az F0 állatokban.

DNS és morfolino oligonukleotidok szerkezete. R és R ‘az oligomer lánc folytatódását jelöli 5’ vagy 3 ‘ irányban.

az antiszensz oligonukleotidok használatának egyik fő akadálya a célszekvencia kiválasztása. A DNS-t tartalmazó antiszensz oligonukleotidok képesek RNS-DNS hibrideket képezni. Ezek a hibridek szubsztrátként működhetnek az RNáz H számára, ami elősegíti az mRNS cél hasítását. Mivel az RNS lebomlik, a célgén kódoló régiójában található bármely szekvencia hasznos antiszensz hely lehet. A morfolinók ezzel szemben RNS-morfolino hibrideket képeznek, amelyek nem szubsztrátjai az RNáz H-nak, így az mRNS nem bomlik le. Ez fontos szempont, mivel a kódoló régió nagy részét megcélzó morfolinókat a riboszóma kiszorítja, amikor az mRNS mentén transzlokálódik, ezért hatástalan lesz a transzláció megakadályozásában. Az 5′-nem lefordított régióra (UTR) vagy a start kodonra célzott morfolino oligonukleotidok előnyösen működhetnek, megakadályozva a transzlációs gépezet kötődését, de nincs garancia arra, hogy ez általános szabály, és minden célgén esetében empirikusan kell bizonyítani.

Ekker és munkatársai beszámoltak arról, hogy fluoreszcens módon jelölt morfolino oligonukleotidok injektálhatók gömb-stádiumú zebrafish embriókba, és egyenletes eloszlást érhetnek el. A zöld fluoreszcens fehérje (GFP) start kodonjára célzott morfolino oligomerek blokkolták a GFP expresszióját, míg a kontroll oligomerek, amelyek kiegészítik a GFP-t, nem. A GFP mRNS szintje nem változott, ami várható, ha az RNase H nem vesz részt. Ezek a modellkísérletek azért jelentősek, mert megállapítják a morfolino oligomerek azon képességét, hogy egyértelműen blokkolják a génexpressziót szekvenciaspecifikus módon. Ekker és munkatársai számos endogén zebrafish gén gátlásáról is beszámoltak, és elkezdték összeállítani egy adatbázist, amely részletezi a morfolino oligonukleotidok által termelt fenotípusokat .

az Ekker és munkatársai által morpholinos alkalmazásával vizsgált útvonalak közé tartozik a Sonic hedgehog ligandumon keresztüli fejlődési jelátvitel és a VEGF-A angiogén növekedési faktor génexpresszió angiogenezisre gyakorolt hatása. Összességében az Ekker laboratórium érdekes fenotípusokat figyelt meg 16 a 17 megcélzott gének . Hammerschmidt és munkatársai megvizsgálták az I. típusú szerin/treonin kináz receptor gén alk8/Lost-A-fin. Lin és munkatársai arról számoltak be, hogy a cink-ujj fehérjét kódoló Fez morfolinóinak gátlása csökkentheti a dlx2 expresszióját, amely egy homeodomain tartalmú fehérjét kódol a ventrális előagyban. Ahol az expressziós szinteket vizsgálták, a génexpresszió jelentős (akár 90% – os) leütését sikerült elérni .

a zebrahalon kívüli organizmusokban Angerer és kollégái morfolinókat használtak, hogy megakadályozzák az spkr1 transzkripciós faktor transzkripciós faktorának transzkripciós faktorát a tengeri sünök embrióiban . Mint Nasevicius et al. , a GFP expresszió leütését pozitív kontrollként használták, és a 4-es bevezetése az anti-SpKr1 morfolino azt eredményezte, hogy az endoderma nem tudott differenciálódni. Heasman et al. tanulmányozták a Xenopus-ban a 6catenin jelátvitelt . A 2 vagy 4 cellás szakaszban történő injekció blokkolja a hátsó tengely kialakulását, míg a 8 cellás szakaszban történő injekció blokkolja a fej kialakulását . Végül Erickson és kollégái elektroporációval juttatták el a FoxD3 ellen irányuló morfolinókat csirkeembriókba. A FoxD3 egy szárnyas hélix osztályú transzkripciós faktor, a morfolinók bevezetése pedig megváltoztatja a neurális címersejtek előrehaladását, ami összhangban van a FoxD3 lokalizációjával . Ezek a kísérletek szemléltetik a morfolinók azon lehetőségét, hogy finoman boncolják a fejlődés időbeli előrehaladását. Ismeretlen funkciójú gén blokkolásakor vagy váratlan eredmény megfigyelésekor fontos szem előtt tartani, hogy az új fenotípus nem feltétlenül a célgén expressziójának csökkenéséből adódik. Ez a figyelmeztetés a standard genetikai kiütések esetében is jelen van, és egyszerűen azt jelenti, hogy az eredményeket óvatosan kell értelmezni.

ezek az adatok provokatívak, és arra utalnak, hogy legalább ezekben az állatmodellekben a morfolino antiszensz oligomerek rutinszerű eszközökké válhatnak a mutáns fenotípusok előállításához. Fontos azonban felismerni, hogy az antiszensz technológia ritkán, ha valaha is duplikálja a teljes funkcióvesztést okozó mutációkat. Arra is figyelmeztetünk, hogy az antiszensz reagenseket a múltban széles körben visszaélték. A kontrollok hiányoztak, az eredmények gyakran marginálisak, és a megfigyelt fenotípusokról gyakran kiderült, hogy a váratlan, nem antiszensz mechanizmusok széles skálájának köszönhetők. Ezen nem antiszensz hatások okai közé tartoznak a fehérjékkel való nem szándékos kölcsönhatások és a nem célzott nukleinsavszekvenciákhoz való kötődés . Ezért elengedhetetlen, hogy a módszertant gondosan alkalmazzák, hogy elkerüljék a múltbeli hibák megismétlését, amelyek lelassították az antiszensz technológia fejlődését.

mint minden antiszensz kísérletnél, a nem specifikus hatások szigorú ellenőrzése kritikus fontosságú a fenotípusok megfelelő értelmezéséhez. A morfolino oligonukleotidokkal végzett kísérletekben mindig legalább egy eltérést és egy kódolt kontroll oligomert kell vizsgálni, és ezeknek a vizsgálatoknak az eredményeit jelenteni kell. A specifikus fenotípus indukálása és a toxicitás kialakulása közötti határérték meghatározására szolgáló dózis-válasz vizsgálatok szintén fontosak. Például ez a különbözet kevesebb lehet, mint kétszeres, hangsúlyozva a gondosan ellenőrzött dózismeghatározás és a pontosan mennyiségi adagolás szükségességét. Amikor csak lehetséges, mind a célfehérje, mind egy vagy több kontrollfehérje szintjét kísérleti és kontroll morfolinókkal kezelt mintákban kell értékelni. Ezenkívül Ekker azt javasolja, hogy az eredményeket mRNS-mentéssel és/vagy a meglévő mutánsok fenotípusaival való összehasonlítással erősítsék meg .

a morfolino oligonukleotidok által a génexpresszió gátlásának magas sikerességi aránya meglepő. Az antiszensz mező dogmája az, hogy az ATG kezdőhelyének megcélzása nem biztos recept a sikerhez, és hogy akár 40 oligonukleotidot is meg kell vizsgálni annak azonosításához, amely hatékonyan gátolja a génexpressziót . Ha a start kodon célzása olyan jól működik, miért nem teszi ezt több nyomozó, ahelyett, hogy bonyolult képernyőkhöz folyamodna? A morfolinók hatékonyabbak lehetnek, mint más antiszensz kémiák, de miért? Ez utóbbi kérdést tulajdonságaik szisztematikus vizsgálatával és más típusú oligonukleotidokkal való összehasonlítással kell megoldani. A drámaian megváltozott morfolino gerinc talán hatékonyabban kötődik az mRNS-hez, vagy jobb blokkként szolgálhat a fordításhoz. Ha igen, a morfolinók kiváló szerek lehetnek a géngátláshoz képest más típusú oligomerekhez képest, amelyek blokkolhatják a transzlációt, például zárolt nukleinsav (LNS), peptid nukleinsav (PNS) vagy 2′-módosított RNS . Másrészt más típusú oligomerek is működhetnek, vagy jobb, mint a morfolinók, de potenciáljuk kevésbé nyilvánvaló, mert nem tesztelték őket kedvező kísérleti rendszerekben.

a nem specifikus kölcsönhatásokból eredő félrevezető megfigyelések sok korábbi kutatást megzavartak oligonukleotidok felhasználásával . Ezek a nehézségek sok kutatót arra késztettek, hogy szkeptikusak legyenek az oligonukleotidok alapkutatás eszközeként történő alkalmazásával kapcsolatban. Az elmúlt 18 hónapban megjelent munka azonban azt sugallja, hogy a morfolino oligomerek olyan tulajdonságokkal rendelkezhetnek, amelyek lehetővé teszik a kutatók számára, hogy rutinszerűen tanulságos fenotípusokat generáljanak. Az eredmények izgalmasak, azzal a következménnyel, hogy a morfolino oligomerek általánosan alkalmazható eszközt jelenthetnek a kémiai genetika és a funkcionális genomika számára. Ennek a potenciálnak a megvalósításához meg kell határozni a reagensek hatékonyságát szabályozó tulajdonságokat. Ez az információ lehetővé teszi a kutatók számára, hogy optimalizálják a módszertant és elérjék az adott cél maximális leütését, miközben minimalizálják a zavaró, nem specifikus hatásokat. A morfolino oligomerek felhasználóinak meg kell érteniük azokat a problémákat, amelyek a múltban sújtották az antiszensz mezőt, tanulniuk kell ezekből a kudarcokból, és megfelelő kontroll kísérleteket kell végezniük. Ezek a kontroll kísérletek, legalább annyira, mint az érdekes fenotípusok előállítása, meghatározzák, hogy a morfolino oligonukleotidok az áttörés, amelyet a legújabb kutatások sugallnak.