Identificatie van Profagen en Profaagresten in het genoom van Avibacterium paragallinarum bacterie
Abstract
bacteriële gehele genoomsequencing heeft een overvloed aan profagesequenties als bijproduct opgeleverd en de analyse van deze sequenties heeft manieren blootgelegd waarop Fagen het genoom van hun gastheerbacteriën in verschillende bacteriesoorten hebben beïnvloed. Het doel van deze studie was het identificeren van de faag-gerelateerde sequenties in de ontwerp-assemblage van het avibacterium paragallinarum genoom, de veroorzaker van infectieuze coryza bij pluimvee. De gehele genoomassemblage was niet mogelijk wegens de aanwezigheid van hiaten en / of herhalingen die op de einden van contigs bestaan. Nochtans, onthulde de annotatie van het genoom profetie en de opeenvolgingen van het profagerestant huidig in dit genoom. Van de verkregen resultaten, kon een volledige mu-als bacteriofaag worden geà dentificeerd die avpmuc-2M werd genoemd. een volledige opeenvolging van HP2-als bacteriofaag, genoemd AvpC-2M-HP2, werd ook geà dentificeerd.
1. Inleiding
bacteriofagen werden voor het eerst ontdekt in Engeland, 1915, door Frederick W. Twort en onafhankelijk daarvan in 1917 door Felix d ‘ Herelle aan het Pasteur Instituut in Parijs . Bacteriofagen zijn virussen die bacteriën infecteren en kunnen worden verdeeld in twee groepen volgens hun middelen van interactie met de bacteriële cel, namelijk lytische (virulente) en gematigde (lysogene) Fagen. Lytic Fagen gaan typisch met replicatie het moment na het infecteren van de gastheercel, waar de grote aantallen nieuwe virussen door de lysis van de gastheercel worden vrijgegeven. De gematigde Fagen beginnen niet noodzakelijk replicatie onmiddellijk na besmetting, en afhankelijk van een aantal voorwaarden, kunnen deze Fagen hun chromosoom in het genoom van de gastheercel integreren die aldus stil tot veroorzaakt blijven . Zodra een bacteriofaaggenoom in het genoom van de gastheercel wordt geïntegreerd wordt het bedoeld als een profetie. Profages zijn de primaire verdachten in de aanpassing gebeurtenis van bestaande ziekteverwekkers aan nieuwe gastheren of de opkomst van nieuwe ziekteverwekkers of epidemische klonen . De bacteriën hebben geen seksuele levenscyclus en de uitwisseling van allelen binnen een bevolking wordt vervuld via horizontale genoverdracht, en de bron van dit DNA kan Fagen, onder anderen zijn . Tenzij beperkt door de soortbarrière, kunnen volledige functionele eenheden uit deze bronnen worden ingevoerd en kan het overgedragen DNA van 1 kb tot meer dan 100 kb in grootte variëren en complexe oppervlaktestructuren of zelfs volledige metabolische wegen coderen . Het is al lang vastgesteld dat bacteriofagen tot de pathogeniteit van hun bacteriële gastheren bijdragen aangezien vele genen zijn getoond om overdracht onder bacteriën door Fagen te ondergaan . Deze genen kunnen voor een diverse subset van virulentiefactoren zoals toxine, regelgevende factoren coderen (die de uitdrukking van gastheervirulentiegenen upregulate), en enzymen, die de bacteriële virulentiecomponenten kunnen veranderen .
bacteriële sequencing van het gehele genoom heeft een overvloed aan profagesequenties opgeleverd . De profetieën kunnen zo veel als tussen 10 en 20% van het genoom van een bacterie vormen hoewel veel van deze profetieën cryptisch en in een staat van mutationeel verval zijn . De analyse van deze opeenvolgingen onthulde talrijke manieren waarin de profages het genoom van hun gastheerbacteriën vormen . De profages hebben de capaciteit om hun gastheergenoomarchitectuur te beà nvloeden door de inhoud van het genoom te veranderen, door de organisatie van het genoom te wijzigen, of door de plaats en de Orde van genen te veranderen . De gematigde bacteriofagen spelen een ingewikkelde rol in de generatie van microbiële diversiteit en in de evolutie van bacteriële genomen door de bemiddeling van herschikking binnen het bacteriële chromosoom en dientengevolge dragen zij beduidend tot interstreinverschillen binnen de zelfde bacteriële species bij . Ter vergelijking, twee stammen van Streptococcus pyogenes behoren tot verschillende M-serotypen en ze zijn niet verbonden met verschillende ziekten—maar wanneer deze stammen op DNA-niveau werden vergeleken de belangrijkste verschillen gecorreleerd aan profage sequenties . Een ander voorbeeld kan binnen Campylobacter jejuni worden waargenomen, waar interstreinverschillen naar intra-genomic inversies van Mu-als opeenvolgingen van profagedna kunnen worden toegeschreven . De vergelijkingen tussen colinear genomen toonden aan dat de hiaten tussen de relevante genomen aan de aanwezigheid van profageopeenvolgingen of als resultaat van herschikte bacteriële genomen werden toegeschreven . In veel gevallen dienen de profages met beperkte de opeenvolgingsidentiteit van DNA of gedupliceerde profages als het verankeren van punten voor homologe nieuwe combinatie . Daarnaast profages kunnen recombineren met andere profages die bijdragen aan hun mozaïek structuur .
Avibacterium paragallinarum is een pathogeen gericht op kippen en veroorzaakt de ziekte infectieuze coryza . Fylogenetisch behoort deze bacterie tot de Pasteurellaceae familie en was voorheen bekend als Haemophilus paragallinarum omgedoopt in 2005 . De familie Pasteurellaceae bestaat uit nauw verwante bacteriën en binnen deze familie zijn verschillende bacteriofagen gemeld in Haemophilus influenzae, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Pasteurella multocida en Mannheimia haemolytica. Bacteriofaag-achtige sequenties zijn gemeld in Histophilus somni . In dit artikel beschrijven we profage en profage restanten gedetecteerd in Av. paragallinarum.
2. Materialen en methoden
2.1. Bacteriestammen en groeicondities
Av. paragallinarum stam C-2 (Modesto) is verkregen uit Onderstepoort biologische producten, Onderstepoort, Zuid-Afrika. Stam Modesto is nad + – afhankelijk en werd gekweekt in tm/SN aangevuld met 1% (v/v) kippenserum, 1% (v/v) NAD+ en 0,0005% (m/v) thiamine-oplossing en gekweekt onder zuurstofbeperkende omstandigheden in een kaarsenpot bij 37°C gedurende 16 uur .
2.2. DNA-extractie
genomische DNA-extractie werd uitgevoerd met behulp van een QIAamp DNA Mini kit van Qiagen. De aanbevelingen van de fabrikant werden nauwgezet gevolgd, behalve voor de elutieprocedure waarbij genomisch DNA werd geëlueerd in 2 × 80 µL 10 mM Tris-HCl, pH 8.
2.3. Identificatie van Av. paragallinarum
Av. paragallinarum werd geà dentificeerd door een PCR-protocol te gebruiken dat specifiek voor deze bacterie wordt ontwikkeld . Bovendien, werd het gebied van 16S ribosomal DNA (rDNA) vergroot om av te identificeren. paragallinarum . Het verkregen PCR-product werd uit de agarose-gel verwijderd, gezuiverd en direct gesequenced om mogelijke vreemde genomische DNA-besmetting te voorkomen.
2.4. Genoomassemblage en annotatie
genomische DNA-monsters van Av. paragallinarum stam C-2 (Modesto) werden verzonden naar Agowa Genomics (nu bekend als LGC Genomics), Duitsland, voor GS-FLX Titanium pyrosequencing. De opeenvolgingen / leest die van pyrosequencing worden verkregen werden geassembleerd gebruikend Newbler 2.0.01.14 van 454 het bedrijf van de levenswetenschappen met een identiteit van de overlappingsminimumovereenkomst van 90% en een lengte van de overlappingsminimumovereenkomst van 40 basissen. De sequenties van verkregen contigs werden voorgelegd aan het J. Craig Venter Institute (JCVI) als pseudomolecule voor annotatie. De pijplijn omvat gen vinden met Glimmer , BLAST-Extend-Repraze (BER) zoekopdrachten , verborgen Markov modellen (HMM) zoekopdrachten , Trans membraan verborgen Markov modellen (TMHMM) zoekopdrachten , SignalP voorspellingen, en automatische annotaties van AutoAnnotate. Al deze informatie wordt opgeslagen in een MySQL-database en bijbehorende bestanden die naar onze site is gedownload. De manuele annotatietool Manatee werd gedownload van SourceForge (http://manatee.sourceforge.net/) en gebruikt om de uitvoer van de pijplijn handmatig te bekijken. pDraw32 van ACACLONE-software werd gebruikt om genetische kaarten voor profagegebied te trekken.
2.5. Toetredingsnummers
AvpmuC-2M (toetredingsnr.: JN627905); HP-2 like prophages contig A (JN627906), B (JN627907), en C (JN627908); lamboid profage fragments (toetredingsnummers: JN627909-JN627919); profage integrase genes (toetredingsnummers: JN627920-JN627928).
3. Resultaten en discussie
het gehele genoomsequentieproject van Av. paragallinarum leverde een totaal aantal van 160 743 reads / sequenties door pyrosequencing chemie. Het totale aantal contigs samengesteld uit deze opeenvolgingen was 300 met de grootste contig omvattende 78 465 bp en de gemiddelde Contig grootte langer dan 500 bp was 10 727 bp. Een gesloten genoom kon niet worden geassembleerd voor Av. paragallinarum uit de sequencing resultaten verkregen als gevolg van herhaalde sequenties die bestonden op het einde (s) van contigs of als gevolg van sequentiehiaten tussen contigs. Een pseudogenome molecuul werd samengesteld uit 300 verkregen contigs en naar jcvi voor genoomannotatie verzonden. De annotatieresultaten gaven aan dat een totaal van 7% of 141 open lezingskaders aan phage eiwitfuncties werden toegewezen. De 141 open lezingskaders werden geà dentificeerd op 60 van 300 contigs waar of één of een reeks van profagegenen in kaart werden gebracht. Negen prophage integrase genen werden geà dentificeerd en in kaart gebracht aan zeven van de 60 contigs. Onderzoek naar open leesframes naast de geà dentificeerde integrases toonde geen extra profage-gerelateerde genen aan, maar eerder genen die membraanproteã nen coderen; metabolische proteã nen; ribosomale proteã nen; celmembraan functie eiwitten, of membraanexport eiwitten. Er werd geen significante homologie waargenomen tussen de integrasen.
Mu-achtige profage genen werden geïdentificeerd en in kaart gebracht op 11 verschillende contigs. De 11 contigs werden vergeleken met de genoomkaart van Mu-als Fagen gemeld door . Hier stellen we een vermeende mu-achtige profage voor AV. paragallinarum, AvpmuC-2M (figuur 1). Een groot deel van het mu gen (25) werd geïdentificeerd op een enkel contig bestaande uit 27, 107 bp. Twee bijkomende contigs werden geïdentificeerd als aanvulling op de kaart van een Mu-achtige profage voor Av. paragallinarum.
vermeende genoomrepresentatie van AvpmuC-2M. de drie contigs die werden gebruikt bij de constructie van AvpmuC-2M worden gescheiden door //. Contig maten worden onder elk contig aangegeven in basisparen.
eenenveertig lamboïdengenen werden in 11 verschillende contigs in kaart gebracht (Figuur 2). Met de beschikbare gegevens van het gehele genoom rangschikkend project kon het niet worden geconcludeerd als de lamboidprophage volledig is of als het massief verlies van functioneel DNA heeft ondergaan resulterend in de fragmentatie van het bacteriofaaggenoom en uiteindelijk leidend tot zijn verdwijning .
een volledig lysogeen van een gematigde faag werd geïdentificeerd op een enkel contig binnen het genoom. De opeenvolging van de geà dentificeerde genen is gelijkaardig aan die van H. influenzae HP2 profage. Een nucleotide-aan-nucleotide vergelijking onthulde een zwakke gelijkenis tussen de H. influenzae profage HP2 en de geà dentificeerde profage. De geïdentificeerde profage is daarom uniek voor Av. paragallinarum. We stellen voor om het AvpC-2M-HP2 te noemen.
twee bijkomende contigs bevatten ook HP2-achtige genen (Figuur 3). Verder onderzoek naar de gelijkenis tussen de geïdentificeerde contigs (A, B en C van AcpC-2M-HP2) wees uit dat de drie contigs dezelfde genomische organisatie delen, maar niet identiek zijn.
(a)
b)
(c)
(a)
(b)
(c)
HP2-zoals prophage genetische representatie. De verschillende contigs (a), (b) en (c) die HP2-achtige open leesframes dragen, worden in dit diagram geïllustreerd. Een volledige HP2-als profage AvpC-2M-HP2 werd geà dentificeerd binnen het genoom van Av. paragallinarum Modesto vertegenwoordigd door (c) in dit diagram.
een overvloed aan andere voorspellingsgenen is ook geïdentificeerd, maar kon niet worden toegewezen aan een specifieke faag of faagfamilie.
het in kaart brengen van alle blootgelegde profagegenen stelde ons in staat om twee profages in Av voor te stellen. paragallinarum. Een profage, AvpmyC-2M, lijkt op een Mu-achtige profage, terwijl de andere profage, AvpC-2M-HP2, lijkt op de HP2 profage van H. influenzae.
belangenconflict
De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict bestaat met een van de commerciële identiteiten die in het document worden genoemd.
dankwoord
De auteurs willen JCVI bedanken voor het leveren van de Jcvi Annotatiedienst die hen voorzien van automatische annotatiegegevens en de manuele annotatietool Manatee.