Abstract

Bakteriell hele genomet sekvensering har levert en overflod av profage sekvenser som et biprodukt og analyse av disse sekvensene avslørte måter som fager har påvirket genomet av sine vertsbakterier i ulike bakteriearter. Målet med denne studien var å identifisere fagrelaterte sekvenser i utkastet til samlingen av Avibacterium paragallinarum-genomet, årsaksmidlet til smittsom coryza i fjærfe. Hele genomet montering var ikke mulig på grunn av tilstedeværelsen av hull og / eller gjentar eksisterende på endene av contigs. Men genom annotasjon avslørte profetere og profetere restsekvenser som er tilstede i dette genomet. Fra de oppnådde resultatene kunne en komplett Mu-lignende bakteriofag identifiseres som ble kalt AvpmuC-2M.en komplett sekvens AV HP2-lignende bakteriofag, kalt AvpC-2M-HP2, ble også identifisert.

1. Introduksjon

Bakteriofager ble først oppdaget I England, 1915, Av Frederick W. Twort og uavhengig derav i 1917 Av Felix D ‘ Herelle Ved Pasteur-Instituttet I Paris . Bakteriofager er virus som infiserer bakterier og kan deles inn i to grupper i henhold til deres middel for interaksjon med bakteriecellen, nemlig lytiske (virulente) og tempererte (lysogene) fag. Lytiske fag fortsetter typisk med replikering øyeblikket etter infeksjon av vertscellen, hvor et stort antall nye virus frigjøres gjennom lysis av vertscellen. Tempererte fager starter ikke nødvendigvis replikasjon umiddelbart etter infeksjon, og avhengig av en rekke forhold kan disse fagene integrere sitt kromosom i genomet til vertscellen og dermed forbli stille til indusert . Når et bakteriofaggenom er integrert i vertscellegenomet, blir det referert til som en profet. Profetier er de primære mistenkte i tilpasningen av eksisterende patogener til nye verter eller fremveksten av nye patogener eller epidemiske kloner . Bakterier har ingen seksuell livssyklus og utveksling av alleler i en populasjon er oppfylt via horisontal genoverføring, og kilden til DETTE DNA kan være fager, blant andre . Med mindre det er begrenset av artsbarrieren, kan hele funksjonelle enheter importeres fra disse kildene, og det overførte DNA kan variere fra 1 kb til mer enn 100 kb i størrelse og kan kode komplekse overflatestrukturer eller til og med hele metabolske veier . Det har lenge vært fastslått at bakteriofager bidrar til patogeniteten av deres bakterielle verter, da mange gener har vist seg å gjennomgå overføring mellom bakterier gjennom fager . Disse genene kan kode for en mangfoldig delmengde av virulensfaktorer som toksin, regulatoriske faktorer (som oppregulerer ekspresjonen av vertsvirulensgener) og enzymer, som kan endre bakteriens virulenskomponenter .

Bakteriell helgenomsekvensering har levert en overflod av profagesekvenser . Profetier kan utgjøre så mye som mellom 10 og 20% av en bakteries genom, selv om mange av disse profetiene er kryptiske og i en tilstand av mutasjonell forfall . Analyse av disse sekvensene avslørte mange måter som profeterer forme genomet av deres vertsbakterier . Profetier har evnen til å påvirke deres vert genom arkitektur ved å endre innholdet i genomet, ved å endre organiseringen av genomet, eller ved å endre plasseringen og rekkefølgen av gener . Tempererte bakteriofager spiller en intrikat rolle i genereringen av mikrobielt mangfold og i utviklingen av bakterielle genomer gjennom mekling av omplassering i bakteriekromosomet, og som et resultat bidrar de betydelig til interstrain forskjeller innen samme bakteriearter . Til sammenligning, To Streptococcus pyogenes stammer tilhører forskjellige m serotyper og de er usammenhengende forbundet med ulike sykdommer – men når disse stammene ble sammenlignet PÅ DNA-nivå de viktigste forskjellene korrelert til profage sekvenser . Et annet eksempel kan observeres I Campylobacter jejuni, hvor interstrain forskjeller kan tilskrives intra-genomiske inversjoner Av Mu-lignende profet DNA-sekvenser . Sammenligninger mellom kolineære genomer viste at hull mellom de relevante genomene ble tilskrevet tilstedeværelsen av profagesekvenser eller som et resultat av omarrangerte bakterielle genomer . I mange tilfeller tjener profetier med begrenset DNA-sekvensidentitet eller dupliserte profetier som forankringspunkter for homolog rekombinasjon . I tillegg kan profetier rekombinere med andre profetier som bidrar til deres mosaikkstruktur . Avibacterium paragallinarum er et patogen rettet mot kyllinger og forårsaker sykdommen smittsom coryza . Fylogenetisk tilhører denne bakterien Familien Pasteurellaceae og var tidligere kjent Som Haemophilus paragallinarum omdøpt i 2005 . Familien Pasteurellaceae består av nært beslektede bakterier, og innenfor denne familien har ulike bakteriofager blitt rapportert I Haemophilus influenzae, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Pasteurella multocida og Mannheimia haemolytica. Bakteriofag – lignende sekvenser er rapportert I Histophilus somni . I dette papiret beskriver vi profetere og profetere rester oppdaget i Av. paragallinarum.

2. Materialer og Metoder

2.1. Bakteriestammer og Vekstforhold

Av. paragallinarum stamme C – 2 (Modesto) ble hentet Fra Onderstepoort Biologiske Produkter, Onderstepoort, Sør-Afrika. Stamme Modesto er nad + avhengig og ble dyrket I TM/SN supplert med 1% (v/v) kyllingserum, 1% (v/v) NAD+ og 0,0005% (m/v) tiaminoppløsning og dyrket under oksygenbegrensende forhold i en stearinlysburk ved 37°C i 16 timer .

2.2. DNA-Ekstraksjon

Genomisk DNA-ekstraksjon ble utført ved Bruk Av Et Qiaamp DNA MINISETT Fra Qiagen. Produsentens anbefalinger ble nøye fulgt, med unntak av elueringsprosedyren der genomisk DNA ble eluert i 2 × 80 µ 10 mM Tris-HCl, pH 8.

2.3. Identifikasjon Av Av. paragallinar

Av. paragallinarum ble identifisert ved HJELP AV EN PCR-protokoll utviklet spesielt for denne bakterien . I tillegg ble 16s ribosomalt DNA (rDNA) – regionen forsterket for å identifisere Av. paragallinarum . DET OPPNÅDDE PCR-produktet ble skåret ut fra agarosegelen, renset og sekvensert direkte for å unngå eventuell fremmed genomisk DNA-forurensning.

2.4. Genom Montering og Annotasjon

Genomiske DNA-prøver av Av. paragallinarum stamme C – 2 (Modesto) ble sendt Til Agowa Genomics (nå KJENT som LGC Genomics), Tyskland, FOR GS-FLX Titan pyrosequencing. Sekvenser / leser hentet fra pyrosequencing ble samlet ved Hjelp Av Newbler 2.0.01.14 fra 454 Life Sciences Corporation med en overlapp minimum match identitet på 90% og en overlapping minimum match lengde på 40 baser. Sekvensene av oppnådde contigs ble sendt Til J. Craig Venter Institute (JCVI) som et pseudomolekyl for merknad. Rørledningen inkluderer gene funn Med Glimmer, BLAST-Extend-Repraze (BER) søk, Skjulte Markov Modeller (HMM) søk, Trans Membran Skjulte Markov Modeller (TMHMM) søk, Signal spådommer, og automatiske merknader Fra AutoAnnotate. All denne informasjonen lagres I En MySQL-database og tilhørende filer som ble lastet ned til nettstedet vårt. Det manuelle annoteringsverktøyet Manatee ble lastet ned fra SourceForge (http://manatee.sourceforge.net/) og brukes til å manuelt gjennomgå utdataene fra rørledningen. pDraw32 FRA ACACLONE software ble brukt til å tegne genetiske kart for prophage region.

2.5. Tiltredelsesnummer

AvpmuC-2M (tiltredelsesnummer.: JN627905); HP-2 som profeterer contig A (JN627906), B (JN627907), OG C (JN627908); lamboid profetere fragmenter (tiltredelse nos.: JN627909-JN627919); profetere integrase gener (tiltredelse nos.: JN627920-JN627928).

3. Resultater og Diskusjon

hele genomsekvenseringsprosjektet Av Av. paragallinarum ga totalt 160 743 leser / sekvenser gjennom pyrosequencing kjemi. Det totale antall contig samlet fra disse sekvensene var 300 med den største contig bestående av 78 465 bp og gjennomsnittlig contig størrelse lengre enn 500 bp var 10 727 bp. Et lukket genom kunne ikke monteres for Av. paragallinarum fra sekvenseringsresultatene oppnådd på grunn av gjentatte sekvenser som eksisterte på slutten (e) av contigs eller som et resultat av sekvensgap mellom contigs. Et pseudogenommolekyl ble samlet fra de 300 kontigene som ble oppnådd og ble sendt TIL JCVI for genomannotasjon. Annotasjonsresultater indikerte at totalt 7% eller 141 åpne leserammer ble tildelt fagproteinfunksjoner. De 141 åpne leserammene ble identifisert på 60 av de 300 kontigene hvor enten en eller en serie profagegener ble kartlagt. Ni prophage integrase gener ble identifisert og kartlagt til syv av de 60 contigs. Undersøkelser av åpne leserammer ved siden av de identifiserte integrasene viste ingen ekstra profag-relaterte gener, men heller gener som koder for membranproteiner; metabolske proteiner; ribosomale proteiner; cellemembran funksjon proteiner, eller membran eksport proteiner. Ingen signifikant homologi ble observert mellom integrasene. Mu – lignende profagegener ble identifisert og kartlagt til 11 forskjellige contigs. De 11 contigs ble sammenlignet med genomet kart Over Mu-lignende fag rapportert av . Her foreslår vi en antatte Mu-lignende profet for Av. paragallinarum, AvpmuC-2M (Figur 1). En stor del Av mu-genet (25) ble identifisert på en enkelt contig bestående av 27, 107 bp. To ytterligere contigs ble identifisert fullføre kartet Av En Mu-lignende profet For Av. paragallinarum.

Førtien lamboid gener ble kartlagt til 11 forskjellige contigs (Figur 2). Med dataene som er tilgjengelige fra hele genomsekvenseringsprosjektet, kan det ikke konkluderes om lamboidprofagen er fullført, eller hvis den har gjennomgått massivt tap av funksjonelt DNA som resulterer i bakteriofaggenomfragmentering og til slutt fører til at den forsvinner .

et komplett lysogen av en temperert fag ble identifisert på en enkelt contig i genomet. Rekken av gener identifisert er lik Den For H. influenzae HP2 prophage. En nukleotid-til-nukleotid sammenligning viste en svak likhet Mellom H. influenzae prophage HP2 og den identifiserte prophage. Den identifiserte profetien er derfor unik For Av. paragallinarum. Vi foreslår at du kaller Det AvpC-2M-HP2.

To ekstra contigs inneholdt OGSÅ HP2-lignende gener (Figur 3). Videre undersøkelser av likheten mellom de identifiserte contigs (A, B og C Av AcpC-2m-HP2) indikerte at de tre contigs deler samme genomisk organisasjon, men de er ikke identiske.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

en overflod av andre profaggener har også blitt identifisert, men kunne ikke tilordnes noen bestemt fag eller fagfamilie.

dermed kartlegging av alle de profage gener avdekket tillatt oss å foreslå to profetier I Av. paragallinarum. En profet, AvpmyC-2M, ligner En Mu-lignende profet, mens den andre profet, AvpC-2M-HP2, ligner HP2 profet H. influenzae.

Interessekonflikt

forfatterne erklærer at ingen interessekonflikt eksisterer med noen av de kommersielle identitetene som er nevnt i papiret.

Bekreftelse

forfatterne vil gjerne takke JCVI for å gi Jcvi Annotasjonstjenesten som ga dem automatiske annotasjonsdata og det manuelle annotasjonsverktøyet Manatee.