het toenemende tempo waarin genoomsequencingprojecten worden voltooid, heeft de behoefte aan high-throughput-methoden voor het beheersen van genexpressie doen toenemen. Één mogelijke benadering is het gebruik van antisense oligonucleotides om mRNA te binden en eiwitsynthese te verhinderen. In theorie maakt deze strategie snelle vooruitgang mogelijk van synthese van oligomeren tot observatie van fenotype . In de praktijk, is de antisense technologie geplaagd door een neiging voor niet-specifieke interactie, en deze hebben zijn brede toepassing op biologisch onderzoek vertraagd . Onlangs, nochtans, hebben de verbeteringen in de chemische eigenschappen van oligonucleotides en in ons begrip van hun werkingsmechanisme gecombineerd om hun succesvol gebruik waarschijnlijker te maken. Het werk van een aantal laboratoria stelt nu voor dat morfolino oligonucleotides in zebravis , zee-egel of Xenopus embryo ‘ s kunnen worden microinjected , waar zij genuitdrukking blokkeren en fenotypic gevolgen tijdens de vroege stadia van ontwikkeling veroorzaken.

Morfolino-oligonucleotiden zijn nietionische DNA-analogen beschikbaar van Gene Tools LLC . Zij bezitten veranderde backbone verbindingen vergeleken met DNA of RNA (figuur (Figure1).1). Ondanks hun veranderde ruggengraat, binden morpholinos aan complementaire nucleïnezuursequenties door Watson-Crick base-pairing. Deze binding is niet strakker dan binding van analoge DNA-en RNA-oligomeren, waardoor het gebruik van relatief lange 25-base morfolinos voor antisense genre remming noodzakelijk is. De ruggengraat maakt morfolinos resistent tegen spijsvertering door nucleases. Ook, omdat de backbone negatieve lading mist, wordt gedacht dat morpholinos minder waarschijnlijk om niet selectief met cellulaire proteã nen in wisselwerking te staan; dergelijke interactie vaak obscure de observatie van informatieve fenotypes. De sterke punten van morpholinos als tools voor het onderzoeken van gewervelde ontwikkeling zijn goed beschreven in een recente review door Ekker . Hun grootste voordeel is dat fenotypen snel kunnen worden waargenomen bij F0 dieren met behulp van een relatief goedkope methode.

structuren van DNA en morfolino-oligonucleotiden. R en R’ duiden op voortzetting van de oligomeerketen in respectievelijk de 5′ of 3′ richting.

een belangrijk obstakel voor het gebruik van antisense oligonucleotiden is het kiezen van een doelreeks. Antisense oligonucleotiden die DNA bevatten kunnen RNA-DNA-hybriden vormen. Deze hybriden kunnen als substraat voor RNase h dienst doen, dat splitsing van het mRNA-doel bevordert. Omdat RNA wordt gedegradeerd, heeft om het even welke opeenvolging binnen het codagegebied van het doelgen het potentieel om een nuttige antisense plaats te zijn. Morpholinos, daarentegen, vormen RNA-morpholino hybriden die geen substraten voor RNase H zijn, en dus mRNA niet wordt gedegradeerd. Dit is een belangrijke overweging, omdat morfolinos gericht op het grootste deel van het codeergebied door het ribosoom zal worden verplaatst aangezien het langs mRNA transloceert, en daarom ineffectief in het verhinderen van vertaling zal zijn. Morfolino oligonucleotiden gericht op het 5 ‘ – onvertaalde gebied (UTR) of het startcodon zou bij voorkeur kunnen werken, door te voorkomen dat de vertaalmachines binden, maar er is geen garantie dat dit een algemene regel is en het zal empirisch moeten worden aangetoond voor elk doelgen.

Ekker en collega ’s melden dat fluorescerend geëtiketteerde morfolino-oligonucleotiden kunnen worden geïnjecteerd in sphere-Stadium zebravisembryo’ s en een uniforme verdeling bereiken. Morpholino oligomers gericht op het begincodon voor groene fluorescente proteã ne (GFP) blokkeerde GFP uitdrukking, terwijl de controle oligomers die aan GFP complementair zijn niet. Het niveau van GFP mRNA werd niet veranderd, wat zoals verwacht Is als RNase H niet betrokken is. Deze modelexperimenten zijn significant omdat zij de capaciteit van morpholino oligomers vestigen om genuitdrukking op een opeenvolging-specifieke manier ondubbelzinnig te blokkeren. Ekker en collega ‘ s melden ook remming van verschillende endogene zebravisgenen en zijn begonnen met het samenstellen van een database waarin de fenotypes worden beschreven die door morfolino oligonucleotiden worden geproduceerd .

Pathways onderzocht door Ekker en collega ‘ s die morpholinos gebruikten, omvatten de ontwikkelingssignalering via de sonische egel ligand en het effect van de VEGF-een angiogene groeifactor genexpressie op angiogenese. Over het geheel genomen heeft het Ekker laboratorium interessante fenotypen waargenomen in 16 van de 17 genen waarop het gericht is . Hammerschmidt en collega ‘ s hebben morfolinos onderzocht gericht op het type I serine/threonine kinase receptor gen Alk8/Lost-a-fin. Lin en collega ‘ s hebben gemeld dat inhibitie met morfolinos van fez, die codeert voor een zinkvinger eiwit, de expressie van dlx2, die codeert voor een homeodomain-bevattende eiwit, in de ventrale voorhersenen kan verminderen. Waar expressieniveaus werden onderzocht, werden significante ‘knockdowns’ van genexpressie (tot 90%) bereikt .

bij andere organismen dan zebravis hebben Angerer en collega ’s morfolino’ s gebruikt die zijn ontworpen om de vertaling van SpKr1, een transcriptiefactor Voor β-catenine-Regulatie, in zee-egels te blokkeren . Zoals met het werk van Nasevicius et al. , werd een’ neerhalen ‘ van uitdrukking GFP gebruikt als positieve controle, en de introductie van 4 µM anti-spkr1 morfolino resulteerde in mislukking van endoderm om te onderscheiden. Heasman et al. hebben β-catenin-signalering bestudeerd bij Xenopus . Injectie in het 2 – of 4-celstadium blokkeert de vorming van de rugas, terwijl injectie in het 8-celstadium de vorming van het hoofd blokkeert . Tot slot hebben Erickson en collega ’s elektroporatie gebruikt om morfolino’ s tegen FoxD3 te leveren aan kippenembryo ‘ s. FoxD3 is een gevleugelde-helix-klasse transcriptiefactor, en introductie van morpholinos verandert de vooruitgang van neuraal-crest cellen, een resultaat consistent met de lokalisatie van FoxD3 . Deze experimenten illustreren het potentieel voor morfolino ‘ s om de temporele progressie van ontwikkeling fijn te ontleden. Bij het blokkeren van een gen met onbekende functie of bij het observeren van een onverwacht resultaat, is het belangrijk om in gedachten te houden, echter, dat het nieuwe fenotype niet noodzakelijk te wijten is aan vermindering van de expressie van het doelgen. Dit voorbehoud is ook aanwezig voor standaard genetische knockouts, en impliceert eenvoudig dat de resultaten voorzichtig moeten worden geïnterpreteerd.

deze gegevens zijn provocerend en suggereren dat, tenminste in deze diermodellen, morfolino antisense oligomeren routinematig gereedschap kunnen worden voor het genereren van mutante fenotypen. Het is echter essentieel om te beseffen dat antisense-technologie zelden of nooit volledige ‘loss-of-function’ – mutaties dupliceert. We waarschuwen ook dat antisense reagentia in het verleden op grote schaal zijn misbruikt. De controles ontbraken, de resultaten zijn vaak marginaal,en waargenomen fenotypen zijn vaak te wijten aan een grote verscheidenheid aan onverwachte niet-antisense mechanismen. De oorzaken van deze niet-antisense gevolgen omvatten onbedoelde interactie met proteã nen en het binden aan niet-doelnucleic zure opeenvolgingen . Het is daarom noodzakelijk dat de methodologie zorgvuldig wordt toegepast om herhaling van de fouten uit het verleden die de vooruitgang van antisense technologie hebben vertraagd te vermijden.

zoals bij elk antisense-experiment, zijn rigoureuze controles voor niet-specifieke effecten van cruciaal belang voor het correct interpreteren van fenotypen. Experimenten met morfolino-oligonucleotiden moeten altijd ten minste één mismatch en één gecodeerde controleoligomeer testen en de resultaten van deze tests moeten worden gerapporteerd. Dosis-response assays om de marge te bepalen tussen de inductie van een specifiek fenotype en het begin van toxiciteit zijn ook belangrijk. Deze marge kan bijvoorbeeld minder dan twee keer zo groot zijn, waarbij de nadruk wordt gelegd op de noodzaak van een zorgvuldig gecontroleerde dosisbepaling en een nauwkeurig gekwantificeerde levering. Waar mogelijk moeten de concentraties van zowel het doeleiwit als een of meer controleeiwitten worden geëvalueerd in monsters die met experimentele morfolino ‘ s en controleproteïnen worden behandeld. Daarnaast stelt Ekker voor dat de resultaten worden bevestigd door middel van mRNA rescue en/of door vergelijking met fenotypen van bestaande mutanten .

het hoge succespercentage voor de remming van genexpressie door morfolino-oligonucleotiden is verrassend. Het dogma in het antisense gebied is dat het richten van de ATG beginplaats niet een bepaald recept voor succes is, en dat zo veel zoals 40 oligonucleotides kan moeten worden getest om één te identificeren die genuitdrukking efficiënt remt . Als het richten op het startcodon zo goed werkt, waarom doen meer onderzoekers dit dan hun toevlucht te nemen tot uitgebreide schermen? Morpholinos kan effectiever zijn dan andere antisense chemie, maar waarom? De laatste vraag zal door systematisch onderzoek van hun eigenschappen en vergelijking met andere types van oligonucleotide moeten worden aangepakt. De dramatisch veranderde morpholino backbone kan misschien effectiever aan mRNA binden of als beter blok aan vertaling handelen. Als dat zo is, kunnen morpholinos superieure agenten voor genremming ten opzichte van andere types van oligomeer zijn die vertaling zouden kunnen blokkeren, zoals gesloten nucleïnezuur (LNA), peptide nucleïnezuur (PNA), of 2′-gemodificeerd RNA . Aan de andere kant, zouden andere types van oligomeer evenals, of beter dan, morpholinos kunnen werken, maar hun potentieel kan minder duidelijk zijn omdat zij niet in gunstige experimentele systemen zijn getest.

misleidende waarnemingen als gevolg van niet-specifieke interacties hebben veel eerder onderzoek met behulp van oligonucleotiden verward . Deze moeilijkheden hebben vele onderzoekers geleid om sceptisch van het gebruik van oligonucleotides als hulpmiddel voor fundamenteel onderzoek te zijn. Het werk dat in de afgelopen 18 maanden wordt gepubliceerd suggereert echter dat morfolino-oligomeren eigenschappen kunnen hebben die onderzoekers routinematig toelaten om leerzame fenotypen te genereren. De resultaten zijn opwindend, met de implicatie dat morfolino oligomers een algemeen toepasbaar hulpmiddel voor chemische genetica en functionele genomica zouden kunnen bieden. Om dit potentieel te realiseren, moeten de eigenschappen die de werkzaamheid van deze reagentia bepalen worden bepaald. Deze informatie zal onderzoekers in staat stellen om de methodologie te optimaliseren en maximale ‘knockdown’ van een bepaald doel te bereiken, terwijl het minimaliseren van verstorende, niet-specifieke effecten. Gebruikers van morpholino oligomers moeten de problemen begrijpen die het antisense-gebied in het verleden hebben geplaagd, van deze tegenslagen leren en passende controle-experimenten uitvoeren. Deze controle-experimenten, minstens zoveel als de productie van interessante fenotypen, zullen bepalen of morfolino oligonucleotiden de doorbraak zijn die recent onderzoek suggereert.