Acinetobacter baumannii (A. baumannii) faz com que as infecções adquiridas no hospital (HAI), tais como a pneumonia associada ao ventilador, bacteremia, infecções do trato urinário, meningite e infecções de feridas cirúrgicas , o que leva a um aumento da mortalidade em pacientes. Os factores de risco para estas infecções incluem ventilação mecânica, utilização de antibióticos de largo espectro, tempo de permanência na UCI e coma . Estatisticamente, cerca de 1.000.000 de pessoas globalmente foram infectadas com A. baumannii a cada ano, e metade dessas infecções foram causadas por estirpes multidrogres resistentes (MDR). A taxa de mortalidade da infecção por A. baumannii na UCI foi de 45~60%, chegando mesmo a 84,3% quando os pacientes foram infectados com extensa resistência a drogas (XDR) A. baumannii . In 2017, Carbapenem-resistant A. baumannii (caranguejo) ficou em primeiro lugar em termos de ameaças à saúde humana e urgência de desenvolver antibióticos relevantes, de acordo com a lista de bactérias resistentes aos medicamentos divulgada pela OMS .no entanto, a colistina (CST) e a tegaciclina, os antibióticos mais usados contra o GNB que produz carbapenemase, tornaram-se ineficientes devido à resistência aos antibióticos . Para atingir a eficácia clínica, os médicos tiveram de aumentar a dose de CST e combiná-la com tegaciclina . Infelizmente, para bacteremia e infecções graves do tracto respiratório causadas por caranguejo e XDR-A. baumannii, respectivamente, a terapêutica combinada ainda não funcionou eficazmente . Frente à resistência bacteriana grave, os pesquisadores perceberam que é urgente desenvolver novas estratégias antibacterianas ao invés de confiar em antibióticos tradicionais.

geralmente, existem duas maneiras de projetar novos agentes antimicrobianos. A primeira consiste em inibir a produção de substâncias essenciais para a sobrevivência das bactérias ; a segunda consiste em inibir os factores de virulência ou os genes de resistência aos antibióticos das bactérias patogénicas, a fim de suprimir a patogenicidade ou melhorar a sua sensibilidade aos antibióticos . No entanto, a inibição de um único componente essencial provoca inevitavelmente uma grande pressão evolutiva para as bactérias e promove o desenvolvimento de estirpes resistentes a medicamentos de alto nível . Portanto, a nova estratégia de intervenção visando processos não-enssenciais é a chave para superar a resistência bacteriana . Por exemplo, a inibição dos sistemas de detecção de quórum AbaI/AbaR com agentes inibidores naturais ou sintéticos bloqueia a comunicação entre bactérias e inibe a formação de biofilmes . Como uma classe de importantes fatores de virulência em bactérias, as proteínas da membrana externa (OTP) têm atraído muito mais atenção.os OMPs são uma classe de proteínas integrais únicas de membrana ancoradas em OM, cujas estruturas de β-barrel foram formadas por 8 a 26 cadeias. Existem grandes laços de extensão entre as cadeias do lado extracelular e pequenos laços do lado periplásmico. Estas características dão aos Otídeos alta estabilidade na membrana e capacidade de lutar contra ambientes extremamente duros . Embora diferentes otorrinolaringologistas possuam sequências e funções diferentes, eles compartilham estruturas e propriedades biológicas semelhantes . OMPs de bactérias consistem em fios pares de número, e, o que é importante, a função e o número de corte de pé dependem de suas sequências. Por exemplo, uma vez que as proteínas relacionadas com a virulência, a proteína OmpX de ligação do complemento na E. coli e a proteína Ail de ligação à fibronectina e heparina na Yersinia pestis partilham uma estrutura semelhante comparável, mas a sua identidade Sequencial foi inferior a 45%. A diversidade da sequência OMPs ocorre no terminal n substancialmente mais do que o terminal C, e o sinal β conservado controla dobragem e montagem correta de OMPs .

no Entanto, até agora, os tipos de OMPs em A. baumannii não tenham sido identificados claramente, e apenas a poucos espalhados relatórios estavam disponíveis, incluindo principalmente BamA, LptD, Omp33–36, OmpW. CarO e OprD. BamA como um OMP automaticamente pode inserir em OM e é responsável pela Montagem de outros OMPs ; LptD medeia o transporte de LPS para o exterior da membrana (OM), a perda que pode causar o acúmulo de intermediários e localização de falha de LPS, e, eventualmente, levar ao rompimento da integridade da membrana bacteriana ; Omp33–36 é um canal para a passagem de água, o que pode induzir a apoptose de células hospedeiras por ativação de caspase e regular a autofagia ; OmpW é uma espécie de hidrofóbico porin existente na OM e no citoplasma, e desempenha um importante papel na modulação da homeostase do íon do ferro em bactérias ; CarO e OprD estão relacionadas com a resistência de carbapenem .entre os Umps de A. baumannii, OmpA é o Fator de virulência mais estudado que desempenha papéis-chave na regulação da adesão, agressividade e formação de biofilmes de A. baumannii e resposta imunitária do hospedeiro. A superprodução de OmpA é um fator de risco independente para a taxa de mortalidade de pneumonia nosocomial e bacteremia causada por A. baumannii . Além disso, o nível de expressão do OmpA medido pelo qRT-PCR pode ser usado como um índice de diagnóstico rápido para a resistência aos antibióticos A. baumannii, pelo qual os resultados são altamente consistentes com aqueles através da análise MIC tradicional .esta revisão revisou a estrutura, função e patogênese de AbOmpA, resumiu estratégias terapêuticas visando AbOmpA, e destacou por que AbOmpA é um alvo potencial para o tratamento de A. baumannii.

estrutura e função OmpA

OmpA foi identificado pela primeira vez como uma proteína modificável pelo calor em Escherichia coli (E. coli) em 1974 e purificada originalmente em 1977. Sua massa molecular varia de 28 kDa a 36 kDa . A família OmpA é um grupo de proteínas porinas, expostas à superfície, com elevado número de cópias em Omps de GNB. O domínio N-terminal de OmpA é uma estrutura antiparalelal de β-barrel constituída por oito cadeias transmembranares, de modo a ser incorporado na membrana externa. As oito cadeias são conectadas por quatro loops longos na superfície da membrana externa e três voltas curtas no domínio periplásmico formando C-terminal globular . Mesmo numa estirpe bacteriana específica, as sequências de aminoácidos do OmpA são várias entre várias subclasses .

Nos últimos anos, com a clarificar a estrutura nativa de AbOmpA, os pesquisadores descobriram que os aminoácidos de AbOmpA a partir de uma variedade de isolados clínicos são altamente conservadas (> 89%), enquanto eles não são homólogos humanos proteoma . Ao comparar várias proteínas do tipo OmpA, os dois aminoácidos conservadores, R286 e Asp271, que estão localizados no domínio C-terminal do OmpA, foram identificados. Ambos os aminoácidos se ligam não covalentemente ao diaminopimelato aminoácido (DAP), um componente do peptidoglicano (PGN) . Esta interação sugere que OmpA desempenha um papel fundamental na manutenção da integridade da superfície bacteriana. Geralmente, em espécies GNB, OmpA estabiliza sua estrutura por auto-dimerização, o que impede as conexões de flexão entre a estrutura do barril β e o periplásmico de ser lisado .AbOmpA é essencial para que A. baumannii Adira e invada as células epiteliais

A. baumannii é capaz de entrar e persistir dentro das células hospedeiras. Em primeiro lugar, adere às células hospedeiras, depois invade e translocata para o núcleo. Depois de matar as células hospedeiras, dissemina-se na corrente sanguínea e nos tecidos . AbOmpA media a adesão e invasão de A. baumannii às células epiteliais (Fig. 1a, Painel superior). Comparado com bactérias de tipo selvagem, a estirpe abompa-mutante isogénica é mais difícil de invadir as células hospedeiras. A pré-incubação com abompa recombinante (rAbOmpA) inibe dramaticamente a adesão e invasão de células epiteliais altamente invasivas de A. baumannii 05KA103. E in vivo, a patogênese é retardada pela mutação de AbOmpA, como evidências mostraram que menos carga bacteriana no sangue de um modelo de pneumonia murina . Para o mecanismo de adesão de OmpA, Smani et al. descobriu que era mais fácil para A. baumannii para anexar a 96 placas de poços revestidos com fibronection de que revestido com BSA, e eles identificaram a proteína de ligação com o fibronection foi OmpA, indicando que a ligação de OmpA para firbronectin foi o primeiro passo da interação entre a A. baumannii com células hospedeiras.

Functions of OmpA in A. baumannii. um painel superior. Ao entrar em contacto com células epiteliais, as bactérias escondem OmpA nestas células. O OmpA é capaz de translocar no núcleo e mitocôndria, e estimular a mitocôndria para liberar o citocromo C. Então o citocromo c promove o Fator de indução da apoptose (AIF) para translocar no núcleo e, finalmente, causa apoptose das células epiteliais. Painel inferior. OmpA aumenta a produção de óxido nítrico sintase (iNOS) e a expressão superficial do Receptor 2 Toll-like (TLR2) em células epiteliais, ambas as quais desencadeiam a morte da célula hospedeira. b A baixa concentração, OmpA activa o DCs que, em seguida, estimula as células T CD4+para exercer a resposta Th1, enquanto em alta concentração; OmpA mata DCs induzindo a mitocôndria a libertar ROS. o C AbOmpA pode prender o factor sérico H no soro, causando a paralisia da resposta do complemento. D AbOmpA desempenha um papel dominante na fixação de superfícies abióticas e na formação de matriz biofilme. e AbOmpA é um porin proteína que se localiza na membrana externa, seletivamente, permitindo a permeação de pequenos compostos moleculares

AbOmpA poderia causar diretamente células hospedeiras da morte, se entregou às células hospedeiras através de vesículas de membrana externa (OMVs) . Como mostrado na Fig. 1a, depois de entrar nas células hospedeiras, AbOmpA pode localizar mitocôndrias, levando à libertação de moléculas (como citocromo C, fator indutor de apoptose (AIF)) na fase inicial da infecção por A. baumannii, a FIA degrada o DNA cromossomo e facilita a apoptose das células epiteliais . Além disso, OmpA também pode translocar para o núcleo das células hospedeiras, dependendo de sua monopartite nuclear de localização do sinal (NLS)-“KTKEGRAMNRR”, que, situado entre resíduos 320 e 330 do OmpA. Esta orientação subcelular de rAbOmpA pode induzir a apoptose das células hospedeiras, mas o mecanismo subjacente específico não é claro . rAbOmpA purificado a partir de A. baumannii ATCC19606 na concentração de 6 µg / mL é suficiente para exercer citotoxicidade para as células epiteliais HEp-2 laríngeas humanas . AbOmpA promove A. baumannii a aderir e invadir as células hospedeiras, levando à sua morte localizando-as em mitocôndrias e núcleos, mas se AbOmpA trabalha em outras organelas permanece por explorar.AbOmpA estimula a resposta imunitária inata

AbOmpA também influencia o sistema imunitário do hospedeiro. Embora o tratamento com AbOmpA não influencie o nível de expressão das citoquinas pró-inflamatórias ou da quimiocina, aumenta a produção de óxido nítrico sintase (iNOS) e a expressão superficial do receptor 2 semelhante ao Toll (TLR2) nas células HEp-2 (Fig. 1a, Painel inferior). Ambos são importantes no mecanismo de defesa do hospedeiro. O óxido nítrico (NO) exerce funções bacteriostáticas e bactericidas em infecções pulmonares , e este stress oxidativo fornece outro factor causal à morte celular. E a TLRs reconhece padrões moleculares associados ao patogéneo (cãibras) e desencadeia a resposta imunitária . Os efeitos de AbOmpA nas células dendríticas derivadas da medula óssea (DCs) são ilustrados na Fig. 1b. o AbOmpA a uma concentração de 200 ng/mL activa os DCs através da via TLR2, MAPK e NF-kB, estimulando as células CD4+T para uma resposta Th1 . No entanto, AbOmpA tende a matar DCs em concentrações elevadas (≥3 µg/mL) aumentando as espécies reactivas de oxigénio (ROS) das mitocôndrias . A inoculação com rAbOmpA pode induzir a resposta imunitária do stype 2 em ratinhos, o que danificou o equilíbrio entre IL-4 e INF-c e levou à ocorrência de infecção . Além disso, AbOmpA paralisou o sistema de resposta do complemento prendendo o factor sérico H (Fig. 1c).

AbOmpA induz a formação de biofilmes

Biofilm permite que A. baumannii sobreviva em condições hostis , consistindo principalmente em proteínas, ADN extracelular e polissacáridos. De acordo com as estatísticas dos Institutos Nacionais de Saúde e do centro de doenças e prevenção, 65-80% das infecções humanas foram causadas por bactérias formadoras de biofilmes . Com base nas características multifuncionais da formação de biofilm, foi identificada uma série de genes associados à adesão bacteriana e à formação de biofilm, tais como AbOmpA, beta-lactamase PER-1 (blaPER-1) e proteína associada ao biofilm (Bap) . De facto, o OmpA de A. baumannii ATCC19606 desempenha um papel dominante na formação de biofilmes estáveis na superfície plástica(Fig. 1d). As estirpes mutantes de AbOmpA não formam biofilme, enquanto a reposição do alelo AbOmpA restaura eficientemente a capacidade .

a permeação de pequenos antibióticos moleculares através de AbOmpA

Porinas são apenas proteínas do corpo β Que foram encontradas na membrana externa da GNB. AbOmpA é a porina mais abundante associada à resistência ao fármaco, ligação das células epiteliais e formação de biofilmes . Smani et al. primeiro demonstrou o efeito de AbOmpA no fenótipo de A. baumannii multi-resistente, e descobriu que a depleção do gene OmpA diminuiu os MICs de cloranfenicol, aztreonam e nalidixic em 8, 8 e 2, 67 vezes, respectivamente. Estes dados sugerem que OmpA pode participar na extrusão do composto antibacteriano da região periplásmica e do casal com sistemas de efluxo na membrana interna . O transporte transmembranar controlado por por porinas é uma forma importante de fornecer nutrientes e pequeno composto antibacteriano hidrofílico molecular para as bactérias . Ramkumar et al. descobriu-se que AbOmpA permitiu selectivamente a passagem de pequenos antibióticos moleculares (Fig. 1e). Por exemplo, o ETX2514, o inibidor da β-lactamase de largo espectro, penetra através do AbOmpA e aumenta a actividade antibacteriana do sulbactam de uma forma dependente do AbOmpA. No futuro, a clarificação da estrutura cristalina de AbOmpA revelará a relação entre a estrutura preliminar do substrato, a proteína porina e a permeação, fornecendo mais informações para o design de pequeno substrato molecular .

regulação da expressão AbOmpA

entre o GNB, os factores que influenciam a expressão OmpA são principalmente caracterizados em Escherichia coli, tais como nutrientes, condições de cultura, infecção bacteriofágica e enzimas metabólicas . No entanto, os mecanismos de regulação OmpA de A. baumannii ainda estão sendo explorados. Embora OmpA no GNB possua uma estrutura semelhante de duas partes, sequências de aminoácidos localizados na superfície exterior das bactérias são vários entre diferentes gêneros . Além de aprender com os estudos de E. coli, devemos explorar as características do OmpA em A. baumannii. Nos últimos anos, tem sido demonstrado que AbOmpA é uma proteína da membrana externa relacionada ao estresse, cuja expressão é afetada pelo ambiente interno e externo das bactérias . Durante o estudo dos efeitos da temperatura, secura e privação de nutrientes na sobrevivência a longo prazo da estirpe sensível ATCC19606 e dos isolados clínicos, Bravo Z et al. constatou-se que os genes relacionados com a adesão e a formação de biofilmes, OmpA, bfmR e csuAB estavam todos mal regulados em células famintas, levando a dificuldades na formação de biofilmes e na disseminação de A. baumannii no sangue . A proteína Hfq, um fator bacteriano hospedeiro descoberto pela primeira vez em E. coi, é indispensável para a síntese de RNA do Qb bacteriofágico, e agora é considerado como um regulador transcritional relacionado com as respostas de estresse. A deficiência de Hfq retarda o crescimento celular e aumenta a sensibilidade celular ao estresse ambiental. O nível de expressão da OmpA na estirpe mutante Hfq é dramaticamente inferior ao de uma estirpe de tipo selvagem . Além disso, existe uma correlação causal entre a formação de biofilmes e a expressão de AbOmpA em A. baumannii sob o tratamento de antibióticos em concentrações inibitórias sub-mínimas (MIC). Yoshinori et al. incubadas ATCC19606 e isolados clínicos com 1/2 MIC de polimixina B (PMB) e colistina (CST) por 24 h, respectivamente, e concluiu que houve uma correlação positiva entre o nível de mRNA de AbOmpA e o número de células em biofilme CST tratados ATCC19606 tensão. Os mesmos resultados foram observados em isolados clínicos R3 na presença de PMB . O Meropenem na concentração de 64 µg/mL e 128 µg/mL aumentou a expressão AbOmpA em 1, 81 e 1, 63 dobras, respectivamente .globalmente, existem três factores que estão principalmente envolvidos na regulação do AbOmpA em estudos recentes. Em primeiro lugar, desfavorecidos ambientes, tais como a fome, diminui a produção de AbOmpA, o que torna difícil para A. baumannii para formar biofilme e aderir às células hospedeiras; em Segundo lugar, Hfq, um regulador transcricional, cujo nível de expressão está intimamente relacionada com a de AbOmpA; Finalmente, alguns antibióticos no sub-MIC promover AbOmpA expressão e de formação de biofilme. Embora vários fatores tenham sido comprovados associados com a extração do OmpA em A. baumannii, os mecanismos subjacentes continuam a ser explorados.

estratégias terapêuticas visando AbOmpA

Polipeptido

hoje em dia, o pequeno polipeptídeo sintético que se liga especificamente ao OmpA foi concebido para evitar que A. baumannii contactasse com as células hospedeiras. AOA-2, um cíclico hexapeptide como um bloqueio de agente de AbOmpA sem atividade bactericida diminui a adesão de A. baumannii, Pseudomonas aeruginosa e E. coli para as superfícies de elementos bióticos e abióticos, e melhora significativamente a sensibilidade de A. baumannii a CST na concentração de 125 µg/mL. In vivo, a injecção intraperitoneal de AOA-2 (10 mg/kg) em associação com CST (10 mg/kg) melhorou a taxa de sobrevivência dos ratinhos com bacteremia em 20% . Além disso, alguns peptídeos antimicrobianos clássicos (AMPs) interagindo com AbOmpA foram gradualmente descobertos, que são uma série de peptídeos de defesa endógena para matar bactérias e fungos . Por exemplo, o peptídeo antimicrobiano mielóide bovino (BMAP-28) e seus peptídeos analógicos mataram MDR-A. baumannii interagindo com AbOmpA. Estes compostos começaram a destruir o A. baumannii na concentração de 40 µg / mL em apenas 15 minutos, e após 30 minutos, as células bacterianas foram obviamente danificadas com fuga de citoplasma . Além disso, o LL-37 interagiu com os resíduos de aminoácidos 74-84 do AbOmpA de uma forma dependente da dose, diminuindo a adesão de A. baumannii às células hospedeiras. No entanto, este efeito inibitório do LL-37 na adesão foi muito reduzido após a supressão do AbOmpA . O defensing-5 (HD5) é um peptídeo endógeno que mata o MDR-A. baumannii. A fim de aumentar a atividade antibacteriana de HD5, os resíduos não-catiónicos e não-hidrofóbicos foram substituídos por arginina carregada positivamente para obter um derivado chamado HD5d5, que poderia se ligar fortemente a AbOmpA e, em seguida, exerceu sua função neutralizante da toxina . Embora haja evidências de que o MDR-Staphylococcus aureus é resistente ao LL-37 produzindo enzimas catabólicas , não foi relatado se o A. baumannii poderia desenvolver resistência a AMPs naturais. O peptídeo sintético pequeno, especificamente dirigido a AbOmpA sem actividade bactericida, pode evitar desencadear a pressão de evolução bacteriana e pode ser usado isoladamente ou combinado com outros compostos antibacterianos para exercer efeitos sinérgicos.

vacina

como antigénio ideal da vacina, o AbOmpA é conservado entre várias estirpes clínicas com o genoma que é diferente do genoma humano . Luo G et al. verificou – se que a imunização de ratinhos com 3 µg de rOmpA em hidróxido de alumínio 0,1% (Al (OH)3) melhorou significativamente a taxa de sobrevivência dos animais diabéticos infectados por A. baumannii HUMC1 em 40%, e diminuiu a contagem de colônias bacterianas de todos os órgãos (exceto pulmão) em dez vezes, em comparação com o controle. Além disso, o anticorpo IgG contra rOmpA no soro também foi dramaticamente melhorado . Badmasti F et al. demonstrado que a taxa de sobrevivência de ratos com divulgados sépsis induzida por ATCC19606 foi notavelmente melhorada (70%) após o tratamento com recombinante conservada immunodominant região de AbOmpA (8-346aa), e além disso, a combinação com Bap(1-487aa) também aumentou a taxa de sobrevivência (> 80%) de camundongos infectados por tb-MDR AB-44 . Além disso, alguns derivados de AbOmpA com maior antigenicidade e menor toxicidade foram projetados por ferramentas bioinformáticas e imunoinformáticas. Por exemplo, um romance imunogênicas modelo com 12 costas foi obtido pela modificação de seqüências de aminoácidos de OmpA, em que K320 e K322 foram substituídas por Alanina, “NADEEFWN” foi substituído por “YKYDFDGVNRGTRGTSEEGTL”, “VVQPGQEAAAPAAAQ”, localizado no C-terminal e a posição 1-24 de N – terminal foram removidos. Este antigénio derivado do AbOmpA era capaz de desencadear a produção de anticorpos que matam Pseudomonas aeruginosa e A. baumannii . Outra forma é desenvolver a vacina do DNA, que tem atraído mais atenção devido à eficácia e durabilidade. A vacina do ADN é consideravelmente segura e tolerável porque não contém patogénios enfraquecidos ou mortos durante a sua produção . Hossein et al. gene abompa clonado e inserido num vector de expressão eucariótica pBudCE4. 1 para obter o pbudce4.1–ompA recombinante. Após transfectação com este plasmídeo recombinante, as células dérmicas humanas de fibroblastos (HDF) expressaram efectivamente AbOmpA . Em seguida, avaliaram o potencial imunogénico do pBudCE4.1–ompA no modelo de ratinhos. Após a imunização com esta vacina, a IL-2, a IL-4, a IL-12, a IgM, a IgG e a INF-γ aumentaram drasticamente no soro e mais animais sobreviveram em comparação com o grupo de controlo . No entanto, não devemos ignorar o potencial oncogénico das moléculas recombinantes devido à sua integração aleatória no genoma do hospedeiro.é amplamente aceite que os anticorpos podem ser utilizados para a defesa contra infecções microbianas. A imunização passiva induzida por anticorpos que visam o AbOmpA costumava ser considerada como um método terapêutico potencial para infecções por MDR e XDR-A. baumannii . No entanto, o tratamento com soros anti-OmpA policlonais revelou muitas deficiências inevitáveis, tais como hipersensibilidade imunocomplexa, baixo teor de anticorpos específicos e o potencial perigo de propagação de doenças infecciosas . Recentemente, a tecnologia de anticorpos monoclonais (mAb) contribui para o desenvolvimento de MAB antibacterianos. Em comparação com o policlonal anti-OmpA sera, a mAbs possui mais vantagens, tais como maior segurança, melhor homologia e metas mais específicas . O mAbs tem como alvo OmpA promove macrófagos para matar A. baumannii 307.30 (AB307.30), excepto as cobertas com cápsula espessa, especialmente XDR-A. baumannii. A evidência mostrou que a ligação da nabs a isolados clínicos era muito mais fraca do que a existente entre a Embs e a ATCC19606. Se a cápsula sobre a parede da célula impede que a mAbs se ligue ao XDR-A. baumannii? A estirpe mutante negativa da cápsula K1 (AB307.30) fortemente combinada com o mAbs Anti-OmpA, sugerindo polissacáridos da cápsula podem proteger os locais de ligação do OmpA . A pobre combinação entre mAbs e XDR-A. baumannii precisa ser resolvida mais adiante, e mAbs também pode ser usado para outros epítopos conservados de A. baumannii.