estruturas de ADN e oligonucleótidos morfolinos. R E R’ designa a continuação da cadeia oligomérica na direcção 5′ ou 3′, respectivamente.

um grande obstáculo ao uso de oligonucleótidos antissensos é escolher uma sequência-alvo. Oligonucleótidos antissensos que contêm DNA são capazes de formar híbridos RNA-DNA. Estes híbridos podem atuar como um substrato para RNase H, que promove a clivagem do alvo mRNA. Como o RNA é degradado, qualquer sequência dentro da região de codificação do gene alvo tem o potencial de ser um local útil antissense. Morfolinos, em contraste, formam híbridos RNA-morfolino que não são substratos para RNase H, E assim o ARNm não é degradado. Esta é uma consideração importante, porque morfolinos direcionados para a maior parte da região de codificação serão deslocados pelo ribossomo à medida que se translocam ao longo do ARNm, e, portanto, será ineficaz na prevenção da tradução. Morpholino oligonucleotídeos direcionados para o 5′-untranslated region (UTR) ou o início de codões pode funcionar preferencialmente, impedindo-o de tradução de máquinas de encadernação, mas não há nenhuma garantia de que esta é uma regra geral e terá de ser demonstrado empiricamente para cada gene alvo.

Ekker e colegas relatam que microesferas rotulado morpholino oligonucleotídeos pode ser injetado em esfera-fase de embriões de peixe-zebra e conseguir uma distribuição uniforme. Oligômeros morfolino direcionados para o codão inicial para a expressão GFP (proteína verde fluorescente) bloqueada, enquanto oligômeros de controle que são complementares ao GFP não. O nível de PFP mRNA não foi alterado, o que é como esperado se RNase H não estiver envolvido. Estes experimentos modelo são significativos porque estabelecem a capacidade dos oligômeros morfolino para bloquear inequivocamente a expressão do gene de uma maneira específica de sequência. Ekker e colegas também relataram inibição de vários genes endógenos de peixes-zebra e começaram a compilar uma base de dados detalhando os fenótipos produzidos pelos oligonucleotídeos morfolinos .as vias investigadas por Ekker e colegas usando morfolinos incluem sinalização através do ligando sônico hedgehog e o efeito do VEGF-uma expressão do gene do fator de crescimento angiogênico na angiogênese. No geral, o laboratório Ekker tem observado fenótipos interessantes em 16 dos 17 genes visados . Hammerschmidt e colegas investigaram morfolinos orientados para o gene do receptor da serina/treonina quinase Tipo I, Alk8 / Lost-A-fin. Lin e colegas de trabalho relataram que a inibição com morfolinos de fez, que codifica uma proteína dedo-zinco, pode reduzir a expressão de dlx2, que codifica uma proteína contendo homeodomain, no forebrain ventral. Nos casos em que foram examinados níveis de expressão, foram atingidas “knockdowns” significativos de expressão genética (até 90%).

em organismos que não o peixe-zebra, o Angerer e os colegas utilizaram morfolinos concebidos para bloquear a tradução de SpKr1, um alvo de factor de transcrição para a regulação Da β-catenina, em embriões de ouriços-do-mar . Como com o trabalho de Nasevicius et al. , um ‘knockdown’ da expressão GFP foi usado como um controle positivo, e a introdução de 4 µM anti-SpKr1 morfolino resultou na falha do endoderme para diferenciar. Heasman et al. estudaram a sinalização β-catenina em Xenopus . A injecção no estádio 2 ou 4 células bloqueia a formação do eixo dorsal, enquanto a injecção no estádio 8 bloqueia a formação da cabeça . Finalmente, Erickson e colegas usaram a eletroporação para entregar morfolinos dirigidos contra FoxD3 para embriões de pintos. FoxD3 é um fator de transcrição de classe alada-hélice, e a introdução de morfolinos altera o progresso das células da crista neural, um resultado consistente com a localização da FoxD3 . Estes experimentos ilustram o potencial de morfolinos para dissecar finamente a progressão temporal do desenvolvimento. Ao bloquear um gene de função desconhecida ou ao observar um resultado não previsto, é importante ter em mente, no entanto, que o fenótipo novo não é necessariamente devido à redução da expressão do gene alvo. Esta ressalva também está presente para os knockouts genéticos padrão, e simplesmente implica que os resultados devem ser interpretados cautelosamente.estes dados são provocativos e sugerem que, pelo menos nestes modelos animais, os oligómeros antissensos morfolinos podem tornar-se Ferramentas de rotina para gerar fenótipos mutantes. É essencial perceber, no entanto, que a tecnologia antissense raramente, se alguma vez, duplica mutações completas de “perda de função”. Também alertamos para o facto de os reagentes antissensivos terem sido amplamente utilizados no passado. Os controlos têm faltado, os resultados são muitas vezes marginais, e os fenótipos observados têm sido frequentemente encontrados devido a uma grande variedade de mecanismos inesperados não-antissensivos. As causas destes efeitos não-antissensivos incluem interacções não intencionais com proteínas e ligação a sequências de ácidos nucleicos não visados . É, portanto, imperativo que a metodologia seja aplicada cuidadosamente para evitar repetir os erros do passado que atrasaram o progresso da tecnologia anti-senso.tal como acontece com qualquer experiência Anti-senso, controlos rigorosos para efeitos não específicos são críticos para a interpretação correcta dos fenótipos. As experiências que utilizem oligonucleótidos morfolinos devem sempre testar, pelo menos, um desfasamento e um oligómero de controlo codificado, devendo os resultados destes testes ser comunicados. Também são importantes os ensaios de Dose-resposta para determinar a margem entre a indução de um fenótipo específico e o início da toxicidade. Por exemplo, esta margem pode ser inferior a duas vezes, enfatizando a necessidade de uma determinação de dose cuidadosamente controlada e de uma distribuição quantitativa precisa. Sempre que possível, os níveis da proteína-alvo e de uma ou mais proteínas de controlo devem ser avaliados em amostras tratadas com morfolinos experimentais e de controlo. Além disso, a Ekker sugere que os resultados sejam confirmados através do mRNA rescue e/ou por comparação com os fenótipos de mutantes existentes .

a elevada taxa de sucesso para a inibição da expressão genética por oligonucleótidos morfolinos é surpreendente. O dogma no campo anti-senso é que o alvo do site ATG start não é uma certa receita para o sucesso, e que até 40 oligonucleótidos podem precisar ser testados para identificar um que inibe eficientemente a expressão genética . Se o objetivo do codon inicial funciona tão bem, Por que mais investigadores não fazem isso em vez de recorrer a telas elaboradas? Os morfolinos podem ser mais eficazes do que outros químicos antissensos, mas porquê? Esta última questão terá de ser abordada através da investigação sistemática das suas propriedades e da comparação com outros tipos de oligonucleótidos. A espinha dorsal morfolino dramaticamente alterada pode talvez ligar-se ao mRNA de forma mais eficaz ou agir como um melhor bloco para a tradução. Se assim for, OS morfolinos podem ser agentes superiores para a inibição do gene em relação a outros tipos de oligómero que podem bloquear a tradução, tais como ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico péptido (PNA), ou ARN modificado com 2′. Por outro lado, outros tipos de oligômeros podem funcionar assim como, ou melhor do que, morfolinos, mas seu potencial pode ser menos aparente porque eles não foram testados em sistemas experimentais favoráveis.

observações enganosas resultantes de interações não específicas confundiram muita pesquisa anterior usando oligonucleótidos . Estas dificuldades levaram muitos pesquisadores a serem céticos sobre o uso de oligonucleótidos como uma ferramenta para pesquisa básica. O trabalho publicado nos últimos 18 meses sugere, no entanto, que os oligômeros morfolinos podem ter propriedades que permitem aos pesquisadores gerar fenótipos instrutivos rotineiramente. Os resultados são emocionantes, com a implicação de que os oligômeros morfolino poderiam fornecer uma ferramenta geralmente aplicável para genética química e genômica funcional. Para realizar este potencial, devem ser determinadas as propriedades que regem a eficácia destes reagentes. Esta informação permitirá aos investigadores optimizar a metodologia e atingir o “knockdown” máximo de um determinado alvo, minimizando simultaneamente efeitos confusos e não específicos. Os usuários de oligômeros morfolino devem entender os problemas que têm atormentado o campo anti-senso no passado, aprender com esses contratempos, e realizar experiências de controle apropriadas. Estes experimentos de controle, pelo menos tanto quanto a produção de fenótipos interessantes, irão determinar se os oligonucleotídeos morfolinos são o avanço que pesquisas recentes sugerem.