identifiering av Profager och Profagrester i genomet av Avibacterium paragallinarum-bakterien
Abstrakt
bakteriell helgenomsekvensering har levererat ett överflöd av profagsekvenser som en biprodukt och analysen av dessa sekvenser avslöjade sätt på vilka fager har påverkat genomet hos deras värdbakterier i olika bakteriearter. Syftet med denna studie var att identifiera de fagrelaterade sekvenserna i utkastet till Avibacterium paragallinarum-genomet, det orsakande medlet för infektiös coryza hos fjäderfä. Hela genomet montering var inte möjligt på grund av närvaron av luckor och/eller upprepningar existerande på ändarna av contigs. Genomanmärkning avslöjade emellertid Prof-och Prof-restsekvenser som finns i detta genom. Från de erhållna resultaten kunde en fullständig Mu-liknande bakteriofag identifieras som kallades AvpmuC-2m. en fullständig sekvens av HP2-liknande bakteriofag, benämnd AvpC-2m-HP2, identifierades också.
1. Inledning
bakteriofager upptäcktes först i England, 1915, av Frederick W. Twort och oberoende därav 1917 av Felix d ’ Herelle vid Pasteur Institute i Paris . Bakteriofager är virus som infekterar bakterier och kan delas in i två grupper beroende på deras sätt att interagera med bakteriecellen, nämligen lytiska (virulenta) och tempererade (lysogena) fager. Lytiska fager fortsätter vanligtvis med replikering ögonblicket efter att ha infekterat värdcellen, där ett stort antal nya virus frigörs genom lysen av värdcellen. Tempererade fager startar inte nödvändigtvis replikering omedelbart efter infektion, och beroende på ett antal tillstånd kan dessa fager integrera sin kromosom i värdcellens genom och därmed förbli tysta tills de induceras . När ett bakteriofaggenom är integrerat i värdcellgenomet kallas det en profag. Profager är de främsta misstänkta i anpassningshändelsen av befintliga patogener till nya värdar eller uppkomsten av nya patogener eller epidemiska kloner . Bakterier har ingen sexuell livscykel och utbytet av alleler inom en population uppfylls via horisontell genöverföring, och källan till detta DNA kan vara fager, bland andra . Om inte begränsad av artbarriären kan hela funktionella enheter importeras från dessa källor och det överförda DNA kan sträcka sig från 1 kb till mer än 100 kb i storlek och kan koda komplexa ytstrukturer eller till och med hela metaboliska vägar . Det har länge fastställts att bakteriofager bidrar till patogeniciteten hos deras bakterievärdar, eftersom många gener har visat sig genomgå överföring bland bakterier genom fager . Dessa gener kan koda för en varierande delmängd av virulensfaktorer såsom toxin, regulatoriska faktorer (som uppreglerar uttrycket av värdvirulensgener) och enzymer, vilket kan förändra bakterievirulenskomponenterna .
bakteriell helgenomsekvensering har levererat ett överflöd av profagesekvenser . Profager kan utgöra så mycket som mellan 10 och 20% av en bakteries genom även om många av dessa profager är kryptiska och i ett tillstånd av mutationsförfall . Analys av dessa sekvenser avslöjade många sätt på vilka profager formar genomet hos deras värdbakterier . Profager har förmågan att påverka deras värdgenomarkitektur genom att ändra innehållet i genomet, genom att modifiera genomets organisation eller genom att ändra platsen och ordningen på gener . Tempererade bakteriofager spelar en invecklad roll i genereringen av mikrobiell mångfald och i utvecklingen av bakteriegenom genom förmedling av omarrangemang inom bakteriekromosomen och som ett resultat bidrar de avsevärt till skillnader mellan spänningar inom samma bakterieart . Som jämförelse, två Streptococcus pyogenes-stammar tillhör olika m-serotyper och de är utan samband associerade med olika sjukdomar—men när dessa stammar jämfördes på DNA-nivå korrelerade de viktigaste skillnaderna med profagesekvenser . Ett annat exempel kan observeras inom Campylobacter jejuni, där interstrain skillnader kan tillskrivas intra-genomiska inversioner av Mu-liknande Prof DNA-sekvenser . Jämförelser mellan kolinjära genomer visade att luckor mellan de relevanta genomerna tillskrevs närvaron av profagesekvenser eller som ett resultat av omarrangerade bakteriegenom . I många fall fungerar profager med begränsad DNA-sekvensidentitet eller duplicerade profager som förankringspunkter för homolog rekombination . Dessutom kan profager rekombineras med andra profager som bidrar till deras mosaikstruktur .
Avibacterium paragallinarum är en patogen som riktar sig mot kycklingar och orsakar sjukdomen infektiös coryza . Fylogenetiskt tillhör denna bakterie familjen Pasteurellaceae och var tidigare känd som Haemophilus paragallinarum bytt namn 2005 . Familjen Pasteurellaceae består av närbesläktade bakterier och inom denna familj har olika bakteriofager rapporterats i Haemophilus influenzae, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Pasteurella multocida och Mannheimia haemolytica. Bakteriofagliknande sekvenser har rapporterats i Histophilus somni . I denna uppsats, vi beskriver profage och profage rester detekteras i Av. paragallinarum.
2. Material och metoder
2.1. Bakteriestammar och tillväxtförhållanden
Av. paragallinarum stam C-2 (Modesto) erhölls från Onderstepoort biologiska produkter, Onderstepoort, Sydafrika. Stam Modesto är nad + beroende och odlades i TM/SN kompletterat med 1% (v/v) kyckling serum, 1% (v/v) NAD+, och 0,0005% (m / v) tiamin lösning och odlas under syrebegränsande betingelser i en ljusburk på 37 C i 16 timmar .
2.2. DNA-extraktion
genomisk DNA-extraktion utfördes med användning av ett QIAamp DNA Mini-kit från Qiagen. Tillverkarens rekommendationer följdes noggrant med undantag för elueringsförfarandet där genomiskt DNA eluerades i 2 80 80 mm 80 mm tris-HCl, pH 8.
2.3. Identifiering Av Av. paragallinarum
Av. paragallinarum identifierades med hjälp av ett PCR-protokoll som utvecklats specifikt för denna bakterie . Dessutom förstärktes 16S ribosomalt DNA (rDNA) – regionen för att identifiera av. paragallinarum . Den erhållna PCR-produkten skars ut från agarosgelen, renades och sekvenserades direkt för att undvika eventuell främmande genomisk DNA-kontaminering.
2.4. Genommontering och annotering
genomiska DNA-prover av Av. paragallinarum stam C-2 (Modesto) skickades till Agowa Genomics (nu känd som LGC Genomics), Tyskland, för GS-FLX Titan pyrosequencing. Sekvenser / läsningar erhållna från pyrosequencing monterades med användning av Newbler 2.0.01.14 från 454 Life Sciences Corporation med en Överlappande minsta matchningsidentitet på 90% och en Överlappande minsta matchlängd på 40 baser. Sekvenserna av erhållna contigs lämnades till J. Craig Venter Institute (JCVI) som en pseudomolekyl för anteckning. Rörledningen inkluderar genfynd med Glimmer , BLAST-Extend-Repraze (BER) sökningar , dolda Markov-modeller (HMM) sökningar , Trans membran dolda Markov-modeller (tmhmm) sökningar , SignalP förutsägelser och automatiska anteckningar från AutoAnnotate. All denna information lagras i en MySQL-databas och tillhörande filer som hämtades till vår webbplats. Det manuella annoteringsverktyget Manatee hämtades från SourceForge (http://manatee.sourceforge.net/) och användes för att manuellt granska utmatningen från rörledningen. pDraw32 från ACACLONE software användes för att rita genetiska kartor för prophage region.
2,5. Anslutningsnummer
AvpmuC-2M (anslutningsnummer.: JN627905); HP-2 som prophages contig A (JN627906), B (JN627907) och C (JN627908); lamboid prophage fragment (anslutning nr: JN627909-JN627919); prophage integrase gener (anslutning nr: JN627920-JN627928).
3. Resultat och diskussion
hela genomsekvenseringsprojektet för Av. paragallinarum gav ett totalt antal 160 743 läser / sekvenser genom pyrosequencing Kemi. Det totala antalet contig monterade från dessa sekvenser var 300 med den största contig innefattande 78 465 bp och den genomsnittliga contig-storleken längre än 500 bp var 10 727 bp. Ett slutet genom kunde inte monteras för Av. paragallinarum från sekvenseringsresultaten erhållna på grund av upprepade sekvenser som fanns i slutet(erna) av contigs eller som ett resultat av sekvensgap mellan contigs. En pseudogenommolekyl samlades från de 300 erhållna kontigerna och skickades till JCVI för genomanteckning. Annoteringsresultat indikerade att totalt 7% eller 141 öppna läsramar tilldelades fagproteinfunktioner. De 141 öppna läsramarna identifierades på 60 av de 300 contigs där antingen en eller en serie profaggener kartlades. Nio prophage integrase gener identifierades och kartlades till sju av de 60 contigs. Undersökningar av öppna läsramar intill de identifierade integraserna avslöjade inga ytterligare profagrelaterade gener, utan snarare gener som kodar för membranproteiner; metaboliska proteiner; ribosomala proteiner; cellmembranfunktionsproteiner eller membranexportproteiner. Ingen signifikant homologi observerades mellan integraserna.
Mu-liknande profaggener identifierades och kartlades till 11 olika contigs. De 11 contigs jämfördes med genomkartan av Mu-liknande fager rapporterade av . Här föreslår vi en förmodad Mu-liknande profage för Av. paragallinarum, AvpmuC-2M (Figur 1). En stor del av Mu-genen (25) identifierades på en enda contig innefattande 27 107 bp. Ytterligare två contigs identifierades slutföra kartan över en Mu-liknande profage för Av. paragallinarum.
Fyrtioen lamboidgener kartlades till 11 olika contigs (Figur 2). Med tillgängliga data från hela genomsekvenseringsprojektet kunde det inte avslutas om lamboidprofagen är fullständig eller om den har genomgått massiv förlust av funktionellt DNA som resulterar i fragmentering av bakteriofaggenom och slutligen leder till dess försvinnande .
Lamboid genetisk representation. Olika lambda-gener har kartlagts till de contigs från vilka de identifierades och grupperades enligt associerade funktioner . Början och slutet av contigs indikeras av //.
en fullständig lysogen av en tempererad FAG identifierades på en enda kontig i genomet. Successionen av de identifierade generna liknar den hos H. influenzae HP2 prophage. En nukleotid-till-nukleotid jämförelse avslöjade en svag likhet mellan H. influenzae prophage HP2 och den identifierade prophage. Den identifierade profagen är därför unik för Av. paragallinarum. Vi föreslår att du kallar det AvpC-2m-HP2.
två ytterligare contigs innehöll också HP2-liknande gener (Figur 3). Ytterligare undersökningar av likheten mellan de identifierade contigs (A, B och C av AcpC-2m-HP2) indikerade att de tre contigs delar samma genomiska organisation men de är inte identiska.
(a)
(b)
(C)
(a)
(b)
(C)
ett överflöd av andra profaggener har också identifierats men kunde inte tilldelas någon specifik FAG-eller fagfamilj.
således gjorde kartläggningen av alla de upptäckta profaggenerna oss att föreslå två profager i Av. paragallinarum. En profag, AvpmyC-2m, liknar en Mu-liknande profag, medan den andra profagen, Avpc-2m-HP2, liknar HP2 profag av H. influenzae.
intressekonflikt
författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt med någon av de kommersiella identiteterna som nämns i papperet.
bekräftelse
författarna vill tacka JCVI för att tillhandahålla Jcvi-Annoteringstjänsten som gav dem automatiska annoteringsdata och det manuella annoteringsverktyget Manatee.