abstrakt

bakteriel helgenomsekventering har leveret en overflod af profagesekvenser som et biprodukt, og analysen af disse sekvenser afslørede måder, hvorpå fager har påvirket genomet af deres værtsbakterier i forskellige bakteriearter. Formålet med denne undersøgelse var at identificere de fagrelaterede sekvenser i udkastet til samling af Avibacterium paragallinarum genom, det forårsagende middel til infektiøs løbende næse hos fjerkræ. Hele genomsamling var ikke mulig på grund af tilstedeværelsen af huller og/eller gentagelser, der findes i enderne af contigs. Imidlertid genom annotation afslørede profage og profage rest sekvenser til stede i dette genom. Fra de opnåede resultater kunne en komplet mu-lignende bakteriofag identificeres, der blev betegnet AvpmuC-2m.en komplet sekvens af HP2-lignende bakteriofag, der hedder AvpC-2m-HP2, blev også identificeret.

1. Introduktion

bakteriofager blev først opdaget i England, 1915, af Frederick V. I 1917 ved Pasteur Instituttet i Paris. Bakteriofager er vira, der inficerer bakterier og kan opdeles i to grupper i henhold til deres middel til interaktion med bakteriecellen, nemlig lytiske (virulente) og tempererede (lysogene) fager. Lytiske fager fortsætter typisk med replikation øjeblikket efter infektion af værtscellen, hvor et stort antal nye vira frigives gennem lysis af værtscellen. Tempererede fager starter ikke nødvendigvis replikation umiddelbart efter infektion, og afhængigt af et antal tilstande kan disse fager integrere deres kromosom i værtscellens genom og således forblive tavse, indtil de induceres . Når et bakteriofaggenom er integreret i værtscellegenomet, kaldes det en profage. Profager er de primære mistænkte i tilpasningsbegivenheden af eksisterende patogener til nye værter eller fremkomsten af nye patogener eller epidemiske kloner . Bakterier har ingen seksuel livscyklus, og udvekslingen af alleler inden for en population opfyldes via vandret genoverførsel, og kilden til dette DNA kan blandt andet være fager . Medmindre det er begrænset af artsbarrieren, kan hele funktionelle enheder importeres fra disse kilder, og det overførte DNA kan variere fra 1 kb til mere end 100 kb i størrelse og kan kode komplekse overfladestrukturer eller endda hele metaboliske veje . Det er længe blevet fastslået, at bakteriofager bidrager til patogeniciteten af deres bakterielle værter, da mange gener har vist sig at undergå overførsel blandt bakterier gennem fager . Disse gener kan kode for en forskellig delmængde af virulensfaktorer såsom toksin, regulatoriske faktorer (som opregulerer ekspressionen af værtsvirulensgener) og f .eks.

bakteriel helgenomsekventering har leveret en overflod af profagesekvenser . Profager kan udgøre så meget som mellem 10 og 20% af en bakteries genom, selvom mange af disse profager er kryptiske og i en tilstand af mutationsforfald . Analyse af disse sekvenser afslørede adskillige måder, hvorpå profager former genomet til deres værtsbakterier . Profager har evnen til at påvirke deres værtsgenomarkitektur ved at ændre indholdet af genomet, ved at ændre organiseringen af genomet eller ved at ændre placeringen og rækkefølgen af gener . Tempererede bakteriofager spiller en indviklet rolle i dannelsen af mikrobiel mangfoldighed og i udviklingen af bakterielle genomer gennem mægling af omlejring inden for bakteriekromosomet, og som et resultat bidrager de markant til interstrainforskelle inden for den samme bakterieart . Til sammenligning hører to Streptococcus pyogenes-stammer til forskellige m-serotyper, og de er ikke forbundet med forskellige sygdomme—men når disse stammer blev sammenlignet på DNA-niveau, korrelerede de vigtigste forskelle med profagesekvenser . Et andet eksempel kan observeres inden for Campylobacter jejuni, hvor interstrainforskelle kan tilskrives intra-genomiske inversioner af Mu-lignende profag-DNA-sekvenser . Sammenligninger mellem colinear genomer viste, at huller mellem de relevante genomer blev tilskrevet tilstedeværelsen af profagesekvenser eller som et resultat af omarrangerede bakterielle genomer . I mange tilfælde tjener profager med begrænset DNA-sekvensidentitet eller duplikerede profager som forankringspunkter for homolog rekombination . Derudover kan profager rekombineres med andre profager, der bidrager til deres mosaikstruktur . Avibacterium paragallinarum er et patogen, der er rettet mod kyllinger og forårsager sygdommen infektiøs løbende næse . Fylogenetisk tilhører denne bakterie Pasteurellaceae-familien og blev tidligere kendt som Haemophilus paragallinarum omdøbt i 2005 . Familien Pasteurellaceae består af nært beslægtede bakterier, og inden for denne familie er der rapporteret om forskellige bakteriofager i Haemophilus, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Pasteurella multocida og Mannheimia haemolytica. Bakteriofaglignende sekvenser er blevet rapporteret i Histophilus somni . I dette papir beskriver vi profage og profage rester opdaget i Av. paragallinarum.

2. Materialer og metoder

2.1. Bakteriestammer og vækstbetingelser

Av. paragallinarum stamme C-2 (Modesto) blev opnået fra Onderstepoort biologiske produkter, Onderstepoort, Sydafrika. Stamme Modesto er nad + afhængig og blev dyrket i TM/SN suppleret med 1% (v/v) kyllingeserum, 1% (v/v) NAD+ og 0,0005% (m/v) thiaminopløsning og dyrket under iltbegrænsende forhold i en lyskrukke ved 37 liter C i 16 timer .

2, 2. DNA-ekstraktion

genomisk DNA-ekstraktion blev udført ved brug af et CHIAAMP DNA Mini kit fra Chiagen. Producentens anbefalinger blev omhyggeligt fulgt med undtagelse af elueringsproceduren, hvor genomisk DNA blev elueret i 2 liter 80 liter 10 mM Tris-HCl, pH 8.

2, 3. Identifikation af Av. paragallinarum

Av. paragallinarum blev identificeret ved anvendelse af en PCR-protokol udviklet specifikt til denne bakterie . Derudover blev 16S ribosomalt DNA (rDNA) – regionen forstærket for at identificere Av. paragallinarum . Det opnåede PCR-produkt blev udskåret fra agarosegelen, oprenset og direkte sekventeret for at undgå enhver mulig fremmed genomisk DNA-kontaminering.

2, 4. Genomsamling og Annotation

genomiske DNA-prøver af Av. paragallinarum stamme C – 2 (Modesto) blev sendt til Agua Genomics (nu kendt som LGC Genomics), Tyskland, til Titanium Pyrosekventering. Sekvenser / læsninger opnået fra pyrosekventeringen blev samlet ved hjælp af Nybler 2.0.01.14 fra 454 Life Sciences Corporation med en Overlappende minimum match identitet på 90% og en overlapning minimum match længde på 40 baser. Sekvenserne af opnåede contigs blev forelagt J. Craig Venter Institute (JCVI) som et pseudomolekyle til annotation. Rørledningen omfatter genfinding med Glimmer, blast-udvide-Reprasere (ber) søgninger, Skjulte Markov modeller (HMM) søgninger , Trans membran Skjulte Markov modeller (TMHMM) søgninger , signal forudsigelser , og automatiske anmærkninger fra AutoAnnotate. Alle disse oplysninger er gemt i en database og tilhørende filer, som blev hentet til vores hjemmeside. Det manuelle annotationsværktøj Manatee blev hentet fra SourceForge (http://manatee.sourceforge.net/) og bruges til manuelt at gennemgå output fra rørledningen. ptræk32 fra ACACLONE blev brugt til at tegne genetiske kort for prophage region.

2, 5. Tiltrædelsesnumre

AvpmuC-2m(tiltrædelsesnr.: JN627905); HP-2-lignende profager contig a (JN627906), B (JN627907) og C (JN627908); lamboid-profagefragmenter (tiltrædelsesnummer: JN627909-JN627919); profageintegrase-gener (tiltrædelsesnummer: JN627920-JN627928).

3. Resultater og diskussion

hele genomsekventeringsprojektet af Av. paragallinarum gav et samlet antal på 160 743 læsninger/sekvenser gennem pyrosekvenskemi. Det samlede antal contigs samlet fra disse sekvenser var 300 med den største contig omfattende 78 465 bp og den gennemsnitlige contig størrelse længere end 500 bp var 10 727 bp. Et lukket genom kunne ikke samles til Av. paragallinarum fra sekventeringsresultaterne opnået på grund af gentagne sekvenser, der eksisterede i slutningen(e) af contigs eller som et resultat af sekvensgab mellem contigs. Et pseudogenommolekyle blev samlet fra de opnåede 300 contigs og blev sendt til JCVI til genomanmærkning. Annotationsresultater viste, at i alt 7% eller 141 åbne læserammer blev tildelt fagproteinfunktioner. De 141 åbne læserammer blev identificeret på 60 af de 300 contigs, hvor enten en eller en række profagegener blev kortlagt. Ni prophage integrase gener blev identificeret og kortlagt til syv af de 60 contigs. Undersøgelser af åbne læserammer ved siden af de identificerede integraser afslørede ingen yderligere profagerelaterede gener, men snarere gener, der koder for membranproteiner; metaboliske proteiner; ribosomale proteiner; cellemembranfunktionsproteiner eller membraneksportproteiner. Der blev ikke observeret nogen signifikant homologi mellem integraserne.

Mu-lignende profagegener blev identificeret og kortlagt til 11 forskellige contigs. Det 11 contigs blev sammenlignet med genomkortet over Mu-lignende fager rapporteret af . Her foreslår vi en formodet mu-lignende profage for Av. paragallinarum, AvpmuC-2m (Figur 1). En stor del af Mu-genet (25) blev identificeret på en enkelt contig omfattende 27.107 bp. To yderligere contigs blev identificeret ved at udfylde kortet over en Mu-lignende profage for Av. paragallinarum.

Figur 1

formodet genomrepræsentation af AvpmuC-2m. de tre contigs, der blev brugt i konstruktionen af AvpmuC-2m, adskilles af//. Contig størrelser er angivet under hver contig i basepar.

enogfyrre lamboidgener blev kortlagt til 11 forskellige contigs (figur 2). Med de tilgængelige data fra hele genomsekventeringsprojektet kunne det ikke konkluderes, om lamboid-profagen er fuldstændig, eller hvis den har gennemgået massivt tab af funktionelt DNA, hvilket resulterer i bakteriofaggenomfragmentering og i sidste ende fører til dens forsvinden .

figur 2

lamboid genetisk repræsentation. Forskellige lambda-gener er blevet kortlagt til de contigs, hvorfra de blev identificeret og grupperet efter tilknyttede funktioner . Begyndelsen og slutningen af contigs er angivet med //.

et komplet lysogen af en tempereret fag blev identificeret på en enkelt contig i genomet. Arvefølgen af de identificerede gener svarer til H. influensae HP2 prophage. En sammenligning mellem nukleotid og nukleotid afslørede en svag lighed mellem H. influensae-profagen HP2 og den identificerede profage. Den identificerede profag er derfor unik for Av. paragallinarum. Vi foreslår at kalde det AvpC-2m-HP2.

to yderligere contigs indeholdt også HP2-lignende gener (figur 3). Yderligere undersøgelser af lighed mellem de identificerede contigs (A, B og C af AcpC-2m-HP2) viste, at de tre contigs deler den samme genomiske organisation, men de er ikke identiske.

(a)

(b)

(b)

(c)

(C)

(a)
(b)
(C)

figur 3

HP2-lignende profagegenetisk repræsentation. De forskellige contigs (A), (b) og (c), der bærer HP2-lignende åbne læserammer, er illustreret i dette diagram. En komplet HP2-lignende profag AvpC-2m-HP2 blev identificeret i genomet af Av. paragallinarum Modesto repræsenteret ved (c) i dette diagram.

en overflod af andre profagegener er også blevet identificeret, men kunne ikke tildeles nogen specifik fag-eller fagfamilie.

således tillod kortlægningen af alle de afdækkede profaggener os at foreslå to profager i Av. paragallinarum. En profage, AvpmyC-2m, ligner en Mu-lignende profage, mens den anden profage, AvpC-2m-HP2, ligner HP2-profagen af H. influensae.

interessekonflikt

forfatterne erklærer, at der ikke findes nogen interessekonflikt med nogen af de kommercielle identiteter, der er nævnt i papiret.

bekræftelse

forfatterne vil gerne takke JCVI for at levere Jcvi-Annotationstjenesten, som gav dem automatiske annotationsdata og det manuelle annotationsværktøj Manatee.