Abstract

Die bakterielle Gesamtgenomsequenzierung hat eine Fülle von Prophagensequenzen als Nebenprodukt geliefert, und die Analyse dieser Sequenzen ergab, wie Phagen das Genom ihrer Wirtsbakterien in verschiedenen Bakterienarten beeinflusst haben. Ziel dieser Studie war es, die phagenbezogenen Sequenzen im Entwurf des Avibacterium paragallinarum-Genoms, dem Erreger des infektiösen Schnupfens bei Geflügel, zu identifizieren. Eine vollständige Genomassemblierung war aufgrund des Vorhandenseins von Lücken und / oder Wiederholungen an den Enden von Contigs nicht möglich. Die Genomanmerkung ergab jedoch, dass in diesem Genom Prophagen- und Prophagenrestsequenzen vorhanden sind. Aus den erhaltenen Ergebnissen konnte ein vollständiger Mu-ähnlicher Bakteriophage identifiziert werden, der als AvpmuC-2M bezeichnet wurde. Eine vollständige Sequenz von HP2-ähnlichen Bakteriophagen, genannt AvpC-2M-HP2WURDE ebenfalls identifiziert.

1. Einführung

Bakteriophagen wurden erstmals 1915 in England von Frederick W. Twort und unabhängig davon 1917 von Felix d’Herelle am Pasteur-Institut in Paris . Bakteriophagen sind Viren, die Bakterien infizieren und können nach ihren Interaktionsmitteln mit der Bakterienzelle in zwei Gruppen eingeteilt werden, nämlich lytische (virulente) und gemäßigte (lysogene) Phagen. Lytische Phagen verlaufen typischerweise mit Replikation im Moment nach der Infektion der Wirtszelle, wo eine große Anzahl neuer Viren durch die Lyse der Wirtszelle freigesetzt wird. Gemäßigte Phagen beginnen nicht unbedingt sofort nach der Infektion mit der Replikation, und abhängig von einer Reihe von Bedingungen können diese Phagen ihr Chromosom in das Genom der Wirtszelle integrieren und so bis zur Induktion still bleiben . Sobald ein Bakteriophagengenom in das Wirtszellengenom integriert ist, wird es als Prophage bezeichnet. Prophagen sind die Hauptverdächtigen beim Anpassungsereignis bestehender Erreger an neue Wirte oder beim Auftreten neuer Erreger oder epidemischer Klone . Bakterien haben keinen sexuellen Lebenszyklus und der Austausch von Allelen innerhalb einer Population erfolgt über horizontalen Gentransfer, und die Quelle dieser DNA können unter anderem Phagen sein . Sofern nicht durch die Speziesbarriere eingeschränkt, können ganze funktionelle Einheiten aus diesen Quellen importiert werden und die übertragene DNA kann von 1 kb bis mehr als 100 kb groß sein und komplexe Oberflächenstrukturen oder sogar ganze Stoffwechselwege kodieren . Es ist seit langem bekannt, dass Bakteriophagen zur Pathogenität ihrer bakteriellen Wirte beitragen, da gezeigt wurde, dass viele Gene durch Phagen zwischen Bakterien übertragen werden . Diese Gene können für eine Vielzahl von Virulenzfaktoren kodieren, wie Toxin, regulatorische Faktoren (die die Expression von Wirtsvirulenzgenen hochregulieren) und Enzyme, die die bakteriellen Virulenzkomponenten verändern können .

Die Sequenzierung des gesamten bakteriellen Genoms hat eine Fülle von Prophagensequenzen geliefert . Prophagen können zwischen 10 und 20% des Genoms eines Bakteriums ausmachen, obwohl viele dieser Prophagen kryptisch sind und sich in einem Zustand des Mutationszerfalls befinden . Die Analyse dieser Sequenzen ergab zahlreiche Möglichkeiten, wie Prophagen das Genom ihrer Wirtsbakterien formen . Prophagen haben die Fähigkeit, ihre Wirtsgenomarchitektur zu beeinflussen, indem sie den Inhalt des Genoms verändern, indem sie die Organisation des Genoms verändern oder indem sie den Ort und die Reihenfolge der Gene verändern . Gemäßigte Bakteriophagen spielen eine komplizierte Rolle bei der Erzeugung mikrobieller Diversität und bei der Entwicklung bakterieller Genome durch die Vermittlung von Umlagerungen innerhalb des bakteriellen Chromosoms und tragen daher erheblich zu Interstrain-Unterschieden innerhalb derselben Bakterienart bei . Im Vergleich dazu gehören zwei Streptococcus pyogenes-Stämme zu verschiedenen M-Serotypen und sind unverbunden mit verschiedenen Krankheiten assoziiert — aber wenn diese Stämme auf DNA-Ebene verglichen wurden, korrelierten die Hauptunterschiede mit Prophagensequenzen . Ein weiteres Beispiel kann bei Campylobacter jejuni beobachtet werden, wo Interstrain-Unterschiede auf intragenomische Inversionen von Mu-ähnlichen Prophagen-DNA-Sequenzen zurückzuführen sind . Vergleiche zwischen kolinearen Genomen zeigten, dass Lücken zwischen den relevanten Genomen auf das Vorhandensein von Prophagensequenzen oder auf neu angeordnete bakterielle Genome zurückzuführen waren . In vielen Fällen dienen Prophagen mit eingeschränkter DNA-Sequenzidentität oder duplizierte Prophagen als Ankerpunkte für die homologe Rekombination. Darüber hinaus können Prophagen mit anderen Prophagen rekombinieren, was zu ihrer Mosaikstruktur beiträgt .

Avibacterium paragallinarum ist ein Erreger, der auf Hühner abzielt und die Krankheit verursacht infektiöser Schnupfen . Phylogenetisch gehört dieses Bakterium zur Familie der Pasteurellaceae und war früher als Haemophilus paragallinarum bekannt, das 2005 umbenannt wurde . Die Familie Pasteurellaceae besteht aus eng verwandten Bakterien und innerhalb dieser Familie wurden verschiedene Bakteriophagen in Haemophilus influenzae, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Pasteurella multocida und Mannheimia haemolytica berichtet. Bakteriophagen-ähnliche Sequenzen wurden in Histophilus somni berichtet . In diesem Papier, Wir beschreiben Prophagen und Prophagenreste, die in Av nachgewiesen wurden. paragallinarum.

2. Materialien und Methoden

2.1. Bakterienstämme und Wachstumsbedingungen

Av. paragallinarum Stamm C-2 (Modesto) wurde von Onderstepoort Biological Products, Onderstepoort, Südafrika, erhalten. Stamm Modesto ist NAD + -abhängig und wurde in TM / SN, ergänzt mit 1% (v / v) Hühnerserum, 1% (v / v) NAD + und 0,0005% (m / v) Thiaminlösung, kultiviert und unter sauerstoffbegrenzenden Bedingungen in einem Kerzengefäß bei 37 ° C für 16 h kultiviert.

2.2. DNA-Extraktion

Die genomische DNA-Extraktion wurde mit einem QIAamp DNA Mini Kit von Qiagen durchgeführt. Die Empfehlungen des Herstellers wurden akribisch befolgt, mit Ausnahme des Elutionsverfahrens, bei dem genomische DNA in 2 × 80 µL 10 mm Tris-HCl, pH 8, eluiert wurde.

2.3. Identifizierung von Av. paragallinarum

Av. paragallinarum wurde unter Verwendung eines PCR-Protokolls identifiziert, das speziell für dieses Bakterium entwickelt wurde . Zusätzlich wurde die 16S-ribosomale DNA (rDNA) -Region amplifiziert, um Av zu identifizieren. paragallinarum . Das erhaltene PCR-Produkt wurde aus dem Agarosegel herausgeschnitten, gereinigt und direkt sequenziert, um eine mögliche fremdgenomische DNA-Kontamination zu vermeiden.

2.4. Genomassemblierung und Annotation

Genomische DNA-Proben von Av. der Paragallinarum-Stamm C-2 (Modesto) wurde zur GS-FLX-Titanpyrosequenzierung an Agowa Genomics (jetzt bekannt als LGC Genomics), Deutschland, geschickt. Sequenzen / Lesevorgänge, die aus der Pyrosequenzierung erhalten wurden, wurden unter Verwendung der neuen Version 2.0.01.14 von 454 Life Sciences Corporation mit einer Überlappungs-Mindestübereinstimmungsidentität von 90% und einer Überlappungs-Mindestübereinstimmungslänge von 40 % zusammengestellt. Die Sequenzen der erhaltenen Contigs wurden dem J. Craig Venter Institute (JCVI) als Pseudomolekül zur Annotation vorgelegt. Die Pipeline umfasst Gene Finding mit Glimmer , BLAST-Extend-Repraze (BER) -Suchen , Hidden Markov Models (HMM) -Suchen , Trans Membrane Hidden Markov Models (TMHMM) -Suchen , SignalP-Vorhersagen und automatische Annotationen von AutoAnnotate. Alle diese Informationen werden in einer MySQL-Datenbank und den zugehörigen Dateien gespeichert, die auf unsere Website heruntergeladen wurden. Das manuelle Annotationswerkzeug Manatee wurde von SourceForge heruntergeladen (http://manatee.sourceforge.net/) und verwendet, um die Ausgabe aus der Pipeline manuell zu überprüfen. pDraw32 von ACACLONE Software wurde verwendet, um genetische Karten für die Prophagenregion zu zeichnen.

2.5. Beitrittsnummern

AvpmuC-2M (Beitritts-Nr.: JN627905); HP-2-ähnliche Prophagen, die an A (JN627906), B (JN627907) und C (JN627908) anschließen; lamboide Prophagenfragmente (Beitrittsnr.: JN627909-JN627919); Prophagenintegrasegene (Beitrittsnr.: JN627920-JN627928).

3. Ergebnisse und Diskussion

Das whole genome sequencing project von Av. paragallinarum ergab eine Gesamtzahl von 160 743 liest / Sequenzen durch Pyrosequenzierung Chemie. Die Gesamtzahl der aus diesen Sequenzen zusammengesetzten Contigs betrug 300, wobei das größte Contig 78 465 bp umfasste und die durchschnittliche Contig-Größe, die länger als 500 bp war, 10 727 bp betrug. Ein geschlossenes Genom konnte für Av nicht zusammengesetzt werden. paragallinarum aus den Sequenzierungsergebnissen, die aufgrund von Wiederholungssequenzen erhalten wurden, die an den Enden von Contigs vorhanden waren, oder als Ergebnis von Sequenzlücken zwischen Contigs. Aus den erhaltenen 300 Contigs wurde ein Pseudogenom-Molekül zusammengesetzt und zur Genom-Annotation an das JCVI geschickt. Die Annotationsergebnisse zeigten, dass insgesamt 7% oder 141 offene Leserahmen Phagenproteinfunktionen zugeordnet waren. Die 141 offenen Leserahmen wurden auf 60 der 300 Contigs identifiziert, wo entweder ein oder eine Reihe von Prophagen-Genen abgebildet wurden. Neun Prophagen-Integrase-Gene wurden identifiziert und auf sieben der 60 Contigs abgebildet. Untersuchungen an offenen Leserahmen neben den identifizierten Integrasen ergaben keine zusätzlichen prophagenbezogenen Gene, sondern Gene, die Membranproteine kodieren; Stoffwechselproteine; ribosomale Proteine; zellmembranfunktionsproteine oder Membranexportproteine. Es wurde keine signifikante Homologie zwischen den Integrasen beobachtet.

Mu-ähnliche Prophagengene wurden identifiziert und auf 11 verschiedene Contigs abgebildet. Das 11 Contigs wurden mit der Genomkarte von Mu-ähnlichen Phagen verglichen, die von berichtet wurden . Hier schlagen wir einen mutmaßlichen Mu-ähnlichen Prophagen für Av vor. paragallinarum, AvpmuC-2M (Abbildung 1). Ein großer Teil des Mu-Gens (25) wurde an einem einzigen Contig mit 27.107 bp identifiziert. Zwei weitere Contigs wurden auf der Karte eines Mu-ähnlichen Prophagen für Av identifiziert. paragallinarum.

Abbildung 1

Mutmaßliche Genomdarstellung von AvpmuC-2M. Die drei Contigs, die bei der Konstruktion von AvpmuC-2M verwendet wurden, sind durch // getrennt. Contig-Größen sind unter jedem Contig in Basenpaaren angegeben.

Einundvierzig Lamboidgene wurden auf 11 verschiedene Contigs abgebildet (Abbildung 2). Mit den verfügbaren Daten aus dem gesamten Genomsequenzierungsprojekt konnte nicht geschlossen werden, ob der lamboide Prophage vollständig ist oder ob er einen massiven Verlust an funktioneller DNA erlitten hat, was zu einer Fragmentierung des Bakteriophagen-Genoms führt und letztendlich zu seinem Verschwinden führt .

Abbildung 2

Lamboid genetische Darstellung. Verschiedene Lambda-Gene wurden auf die Contigs abgebildet, aus denen sie identifiziert und nach zugehörigen Funktionen gruppiert wurden . Anfänge und Enden der Contigs werden durch // angezeigt.

Ein vollständiges Lysogen eines gemäßigten Phagen wurde an einem einzigen zusammenhängenden Genom identifiziert. Die Abfolge der identifizierten Gene ähnelt der von H. influenzae HP2 prophage. Ein Nukleotid-zu-Nukleotid-Vergleich ergab eine schwache Ähnlichkeit zwischen dem H. influenzae-Prophagen HP2 und dem identifizierten Prophagen. Der identifizierte Prophage ist daher einzigartig für Av. paragallinarum. Wir empfehlen, es AvpC-2M-HP2 zu nennen.

Zwei weitere Contigs enthielten ebenfalls HP2-ähnliche Gene (Abbildung 3). Weitere Untersuchungen der Ähnlichkeit zwischen den identifizierten Contigs (A, B und C von AcpC-2M-HP2) zeigten, dass die drei Contigs die gleiche genomische Organisation teilen, aber sie sind nicht identisch.

(a)

(a)

(b)

(b)

(c)

(c)

(a)
(b)
(c)

Abbildung 3

HP2-ähnliche Prophage genetische vertretung. In diesem Diagramm sind die verschiedenen Anschlußstellen (a), (b) und (c) dargestellt, die HP2-artige offene Leserahmen tragen. Ein kompletter HP2-ähnlicher Prophage AvpC-2M-HP2 wurde innerhalb des Genoms von Av identifiziert. paragallinarum Modesto dargestellt durch (c) in diesem Diagramm.

Eine Fülle anderer Prophagengene wurde ebenfalls identifiziert, konnte jedoch keinem bestimmten Phagen oder keiner Phagenfamilie zugeordnet werden.

Die Kartierung aller entdeckten Prophagen-Gene ermöglichte es uns, zwei Prophagen in Av vorzuschlagen. paragallinarum. Ein Prophage, AvpmyC-2M, ähnelt einem Mu-ähnlichen Prophagen, während der andere Prophage, AvpC-2M-HP2, dem HP2-Prophagen von H. influenzae ähnelt.

Interessenkonflikt

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt mit einer der in der Arbeit genannten kommerziellen Identitäten besteht.

Danksagung

Die Autoren danken JCVI für die Bereitstellung des JCVI Annotation Service, der ihnen automatische Annotationsdaten und das manuelle Annotationstool Manatee zur Verfügung stellte.