Resumen

La secuenciación del genoma completo de bacterias ha proporcionado una abundancia de secuencias de profagos como subproducto y el análisis de estas secuencias reveló formas en que los fagos han afectado el genoma de sus bacterias huésped en varias especies bacterianas. El objetivo de este estudio fue identificar las secuencias relacionadas con los fagos en el ensamblaje preliminar del genoma de Avibacterium paragallinarum, el agente causal de la coriza infecciosa en aves de corral. El ensamblaje del genoma completo no fue posible debido a la presencia de huecos y/o repeticiones existentes en los extremos de los contiguos. Sin embargo, la anotación del genoma reveló secuencias de profetismo y remanentes de profetismo presentes en este genoma. A partir de los resultados obtenidos, se pudo identificar un bacteriófago completo similar a Mu que se denominó AvpmuC-2M. También se identificó una secuencia completa de bacteriófago similar a HP2, llamado AvpC-2M-HP2.

1. Introducción

Los bacteriófagos fueron descubiertos por primera vez en Inglaterra, en 1915, por Frederick W. Twort e independientemente del mismo en 1917 por Felix d’Herelle en el Instituto Pasteur de París . Los bacteriófagos son virus que infectan bacterias y se pueden dividir en dos grupos de acuerdo con sus medios de interacción con la célula bacteriana, a saber, fagos líticos (virulentos) y templados (lisogénicos). Los fagos líticos proceden típicamente con la replicación en el momento después de infectar la célula huésped, donde se liberan grandes cantidades de nuevos virus a través de la lisis de la célula huésped. Los fagos templados no necesariamente comienzan la replicación inmediatamente después de la infección, y dependiendo de una serie de condiciones, estos fagos pueden integrar su cromosoma en el genoma de la célula huésped, permaneciendo así en silencio hasta ser inducidos . Una vez que el genoma de un bacteriófago se integra en el genoma de la célula huésped, se lo conoce como profago. Los profagos son los principales sospechosos en el evento de adaptación de patógenos existentes a nuevos huéspedes o la aparición de nuevos patógenos o clones epidémicos . Las bacterias no tienen ciclo de vida sexual y el intercambio de alelos dentro de una población se realiza a través de la transferencia horizontal de genes, y la fuente de este ADN puede ser fagos, entre otros . A menos que esté restringido por la barrera de especies, se pueden importar unidades funcionales enteras de estas fuentes y el ADN transferido puede variar de 1 kb a más de 100 kb de tamaño y puede codificar estructuras superficiales complejas o incluso vías metabólicas completas . Durante mucho tiempo se ha establecido que los bacteriófagos contribuyen a la patogenicidad de sus huéspedes bacterianos, ya que se ha demostrado que muchos genes se transfieren entre bacterias a través de fagos . Estos genes pueden codificar un subconjunto diverso de factores de virulencia, como toxinas, factores reguladores (que regulan al alza la expresión de los genes de virulencia del huésped) y enzimas, que pueden alterar los componentes de virulencia bacteriana .

La secuenciación del genoma completo de bacterias ha proporcionado una gran cantidad de secuencias de profecías . Las profecías pueden constituir tanto como entre el 10 y el 20% del genoma de una bacteria, aunque muchas de estas profecías son crípticas y en un estado de descomposición mutacional . El análisis de estas secuencias reveló numerosas formas en que los profagos dan forma al genoma de sus bacterias huésped . Las profecías tienen la capacidad de afectar la arquitectura del genoma de su huésped cambiando el contenido del genoma, modificando la organización del genoma o alterando la ubicación y el orden de los genes . Los bacteriófagos templados desempeñan un papel intrincado en la generación de diversidad microbiana y en la evolución de los genomas bacterianos a través de la mediación del reordenamiento dentro del cromosoma bacteriano y, como resultado, contribuyen significativamente a las diferencias entre trenzas dentro de la misma especie bacteriana . En comparación, dos cepas de Streptococcus pyogenes pertenecen a diferentes serotipos M y están inconexamente asociadas con diferentes enfermedades, pero cuando se compararon estas cepas a nivel de ADN, las diferencias clave se correlacionaron con las secuencias de profagos . Otro ejemplo se puede observar dentro de Campylobacter jejuni, donde interstrain diferencias pueden ser atribuidas hacia dentro de la genómica inversiones de Mu-como profago secuencias de ADN . Las comparaciones entre genomas colineales mostraron que las brechas entre los genomas relevantes se atribuyeron a la presencia de secuencias de profagos o como resultado de genomas bacterianos reorganizados . En muchos casos, las profecías con identidad limitada de secuencia de ADN o profecías duplicadas sirven como puntos de anclaje para la recombinación homóloga . Además, las profecías pueden recombinarse con otras profecías que contribuyen a su estructura de mosaico .

Avibacterium paragallinarum es un patógeno dirigido a los pollos y está causando la enfermedad infecciosa coriza . Filogenéticamente, esta bacteria pertenece a la familia Pasteurellaceae y fue conocida anteriormente como Haemophilus paragallinarum, renombrada en 2005 . La familia Pasteurellaceae se compone de bacterias estrechamente relacionadas y dentro de esta familia, se han reportado varios bacteriófagos en Haemophilus influenzae, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Pasteurella multocida y Mannheimia haemolytica. Se han notificado secuencias de tipo bacteriófago en Histophilus somni . En este artículo, describimos profecías y restos de profecías detectados en Av. paragallinarum.

2. Materiales y Métodos

2.1. Cepas Bacterianas y Condiciones de Crecimiento

Av. paragallinarum cepa C-2 (Modesto) se obtuvo de Onderstepoort Biological Products, Onderstepoort, Sudáfrica. La cepa Modesto es dependiente de NAD + y se cultivó en TM / SN suplementado con suero de pollo al 1% (v/v), NAD+ al 1% (v/v) y solución de tiamina al 0,0005% (m/v) y se cultivó en condiciones limitantes de oxígeno en un frasco de velas a 37°C durante 16 h .

2.2. Extracción de ADN

La extracción de ADN genómico se realizó con el uso de un Mini kit de ADN QIAamp de Qiagen. Las recomendaciones del fabricante se siguieron meticulosamente, excepto en el procedimiento de elución, en el que el ADN genómico se eluyó en 2 × 80 µL de 10 mM Tris-HCl, pH 8.

2.3. Identificación de Av. paragallinarum

Av. el paragallinarum se identificó mediante el uso de un protocolo de PCR desarrollado específicamente para esta bacteria . Además, se amplificó la región del ADN ribosómico (ADNr) 16S para identificar Av. paragallinarum . El producto PCR obtenido se extirpó del gel de agarosa, se purificó y se secuenció directamente para evitar cualquier posible contaminación del ADN genómico extraño.

2.4. Ensamblaje y Anotación del genoma

Muestras de ADN genómico de Av. la cepa paragallinarum C-2 (Modesto) se envió a Agowa Genomics (ahora conocida como LGC Genomics), Alemania, para la pirosecuenciación de titanio GS-FLX. Las secuencias / lecturas obtenidas de la pirosecuenciación se ensamblaron utilizando Newbler 2.0.01.14 de 454 Life Sciences Corporation con una identidad de coincidencia mínima de superposición del 90% y una longitud de coincidencia mínima de superposición de 40 bases. Las secuencias de contiguos obtenidos se presentaron al Instituto J. Craig Venter (JCVI) como pseudomolécula para anotación. La tubería incluye búsqueda de genes con Destellos, búsquedas de EXTENSIÓN de EXPLOSIÓN y Repraze (BER), búsquedas de Modelos de Markov Ocultos (HMM), búsquedas de Modelos de Markov Ocultos de Membrana Trans (TMHMM), predicciones de señales y anotaciones automáticas de Autoanotado. Toda esta información se almacena en una base de datos MySQL y archivos asociados que se descargaron en nuestro sitio. La herramienta de anotación manual Manatee se descargó de SourceForge (http://manatee.sourceforge.net/) y se usó para revisar manualmente la salida de la canalización. pDraw32 del software ACACLONE se utilizó para dibujar mapas genéticos para la región de profecías.

2.5. Números de adhesión

AvpmuC-2M (número de adhesión: JN627905); Profagos similares a HP-2 contig A (JN627906), B (JN627907) y C (JN627908); fragmentos de profagos lamboides (números de adhesión: JN627909-JN627919); genes integrasas de profagos (números de adhesión: JN627920-JN627928).

3. Resultados y Discusión

El proyecto de secuenciación del genoma completo de Av. paragallinarum produjo un número total de 160 743 lecturas/secuencias a través de la química de pirosecuenciación. El número total de contigs ensamblados a partir de estas secuencias fue de 300 con el contig más grande que comprendía 78 465 pb y el tamaño promedio de contig más largo que 500 pb fue de 10 727 pb. No se pudo ensamblar un genoma cerrado para Av. paragallinarum de los resultados de secuenciación obtenidos debido a secuencias repetidas que existían en el extremo o extremos de los contiguos o como resultado de intervalos de secuencia entre contiguos. Se ensambló una molécula de pseudogenoma a partir de los 300 contiguos obtenidos y se envió al JCVI para la anotación del genoma. Los resultados de anotación indicaron que un total de 7% o 141 marcos de lectura abiertos fueron asignados a funciones de proteína fágica. Los 141 marcos de lectura abiertos se identificaron en 60 de los 300 contiguos donde se mapearon uno o una serie de genes proféticos. Se identificaron nueve genes de integrasa de profago y se asignaron a siete de los 60 contig. Las investigaciones en marcos de lectura abiertos adyacentes a las integrasas identificadas no revelaron genes relacionados con profagos adicionales, sino genes que codifican proteínas de membrana; proteínas metabólicas; proteínas ribosómicas; proteínas de función de membrana celular, o proteínas de exportación de membrana. No se observó homología significativa entre las integras.

Se identificaron genes proféticos similares a Mu y se asignaron a 11 contiguos diferentes. Los 11 contiguos se compararon con el mapa del genoma de fagos similares a Mu reportados por . Aquí sugerimos un profetismo putativo en forma de Mu para Av. paragallinarum, AvpmuC-2M (Figura 1). Una gran parte del gen Mu (25) se identificó en un solo contig que comprendía 27, 107 pb. Se identificaron dos contiguos adicionales que completaban el mapa de un profetizo en forma de Mu para Av. paragallinarum.

Figura 1.

Putativo del genoma representación de AvpmuC-2M. Los tres contigs que se utilizaron en la construcción de AvpmuC-2M están separados por //. Los tamaños Contig se indican debajo de cada contig en pares de bases.

Cuarenta y un genes lamboides fueron mapeados a 11 contiguos diferentes (Figura 2). Con los datos disponibles del proyecto de secuenciación del genoma completo, no se pudo concluir si el profago lamboide está completo o si ha sufrido una pérdida masiva de ADN funcional que resultó en la fragmentación del genoma del bacteriófago y, en última instancia, condujo a su desaparición .

Figura 2

Lamboid genética de la representación. Se han mapeado varios genes lambda a los contiguos a partir de los cuales se identificaron y agruparon de acuerdo con las funciones asociadas . Los comienzos y los fines de los contiguos se indican con//.

Se identificó un lisógeno completo de un fago templado en un único contig dentro del genoma. La sucesión de los genes identificados es similar a la del profeta H. influenzae HP2. Una comparación de nucleótido a nucleótido reveló una débil similitud entre el profago H. influenzae HP2 y el profago identificado. El profeta identificado es, por lo tanto, exclusivo de Av. paragallinarum. Sugerimos llamarlo AvpC-2M-HP2.

Dos contiguos adicionales también contenían genes similares a HP2 (Figura 3). Investigaciones adicionales de similitud entre los contiguos identificados (A, B y C de AcpC-2M-HP2) indicaron que los tres contiguos comparten la misma organización genómica, pero no son idénticos.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figura 3

HP2-como profago genética de la representación. Los diversos contiguos (a), (b) y (c) que llevan marcos de lectura abiertos tipo HP2 se ilustran dentro de este diagrama. Se identificó un profago completo tipo HP2 AvpC-2M-HP2 dentro del genoma de Av. paragallinarum Modesto representado por (c) en este diagrama.

También se ha identificado una abundancia de otros genes profágicos, pero no se pudo asignar a ningún fago específico o familia de fagos.

Por lo tanto, el mapeo de todos los genes de profagos descubiertos nos permitió sugerir dos profagos en Av. paragallinarum. Una profecía, AvpmyC-2M, se asemeja a una profecía similar a Mu, mientras que la otra, AvpC-2M-HP2, se asemeja a la profecía HP2 de H. influenzae.

Conflicto de Intereses

Los autores declaran que no existe conflicto de intereses con ninguna de las identidades comerciales mencionadas en el artículo.

Reconocimiento

Los autores agradecen a JCVI por proporcionar el Servicio de Anotación de JCVI que les proporcionó datos de anotación automática y la herramienta de anotación manual Manatee.