Le rythme croissant auquel les projets de séquençage du génome sont achevés a accru le besoin de méthodes à haut débit pour contrôler l’expression des gènes. Une approche possible est l’utilisation d’oligonucléotides antisens pour lier l’ARNm et empêcher la synthèse des protéines. En théorie, cette stratégie permet de progresser rapidement de la synthèse des oligomères à l’observation du phénotype. En pratique, la technologie antisens a été en proie à une propension aux interactions non spécifiques, ce qui a ralenti son large application aux études biologiques. Récemment, cependant, des améliorations dans les propriétés chimiques des oligonucléotides et dans notre compréhension de leur mécanisme d’action se sont combinées pour rendre leur utilisation réussie plus probable. Les travaux d’un certain nombre de laboratoires suggèrent maintenant que les oligonucléotides morpholino peuvent être microinjectés dans des embryons de poisson-zèbre, d’oursin ou de xénope, où ils bloquent l’expression des gènes et produisent des effets phénotypiques pendant les premiers stades de développement.

Les oligonucléotides Morpholino sont des analogues d’ADN non ioniques disponibles chez Gene Tools LLC. Ils possèdent des liaisons dorsales altérées par rapport à l’ADN ou à l’ARN (Figure (Figure1).1). Malgré leur squelette altéré, les morpholinos se lient à des séquences d’acides nucléiques complémentaires par appariement de bases Watson-Crick. Cette liaison n’est pas plus serrée que la liaison d’oligomères analogues de l’ADN et de l’ARN, ce qui nécessite l’utilisation de morpholinos à 25 bases relativement longs pour l’inhibition des gènes antisens. L’épine dorsale rend les morpholinos résistants à la digestion par les nucléases. De plus, parce que l’épine dorsale manque de charge négative, on pense que les morpholinos sont moins susceptibles d’interagir de manière non sélective avec les protéines cellulaires; de telles interactions masquent souvent l’observation de phénotypes informatifs. Les forces des morpholinos en tant qu’outils pour étudier le développement des vertébrés sont bien décrites dans une revue récente d’Ekker. Leur plus grand avantage est que les phénotypes peuvent être rapidement observés chez les animaux F0 en utilisant une méthode relativement peu coûteuse.

Structures de l’ADN et des oligonucléotides morpholino. R et R’ désignent la poursuite de la chaîne oligomère dans la direction 5′ ou 3′, respectivement.

Un obstacle majeur à l’utilisation d’oligonucléotides antisens est le choix d’une séquence cible. Les oligonucléotides antisens contenant de l’ADN sont capables de former des hybrides ARN-ADN. Ces hybrides peuvent servir de substrat pour la RNase H, ce qui favorise le clivage de la cible d’ARNm. Étant donné que l’ARN est dégradé, toute séquence dans la région codante du gène cible a le potentiel d’être un site antisens utile. Les morpholinos, au contraire, forment des hybrides ARN-morpholino qui ne sont pas des substrats pour la RNase H, et donc l’ARNm n’est pas dégradé. C’est une considération importante, car les morpholinos ciblés sur la majeure partie de la région codante seront déplacés par le ribosome lorsqu’il se translocera le long de l’ARNm, et seront donc inefficaces pour empêcher la traduction. Les oligonucléotides morpholino ciblés sur la région 5′ non traduite (UTR) ou le codon start pourraient fonctionner préférentiellement, en empêchant la machine de traduction de se lier, mais rien ne garantit qu’il s’agisse d’une règle générale et qu’il faudra la démontrer empiriquement pour chaque gène cible.

Ekker et ses collègues rapportent que des oligonucléotides morpholino marqués par fluorescence peuvent être injectés dans des embryons de poisson zèbre au stade sphérique et obtenir une distribution uniforme. Les oligomères morpholino ciblés sur le codon de départ pour la protéine fluorescente verte (GFP) bloquaient l’expression de la GFP, alors que les oligomères témoins complémentaires à la GFP ne l’ont pas fait. Le taux d’ARNm de la GFP n’a pas été modifié, ce qui est comme prévu si la RNase H n’est pas impliquée. Ces expériences modèles sont significatives car elles établissent la capacité des oligomères morpholino à bloquer sans ambiguïté l’expression des gènes d’une manière spécifique à la séquence. Ekker et ses collègues rapportent également l’inhibition de plusieurs gènes endogènes du poisson zèbre et ont commencé à compiler une base de données détaillant les phénotypes produits par les oligonucléotides morpholino.

Les voies étudiées par Ekker et ses collègues utilisant des morpholinos comprennent la signalisation du développement par le ligand Sonic hedgehog et l’effet de l’expression du gène du facteur de croissance angiogénique VEGF-A sur l’angiogenèse. Globalement, le laboratoire Ekker a observé des phénotypes intéressants dans 16 des 17 gènes ciblés. Hammerschmidt et ses collègues ont étudié les morpholinos ciblés sur le gène du récepteur sérine/thréonine kinase de type I Alk8 / Lost-a-fin. Lin et ses collègues ont rapporté que l’inhibition par les morpholinos de fez, qui code pour une protéine à doigt de zinc, peut réduire l’expression de dlx2, qui code pour une protéine contenant des homéodomaines, dans le cerveau antérieur ventral. Lorsque les niveaux d’expression ont été examinés, des « knockdowns » significatifs de l’expression des gènes (jusqu’à 90%) ont été atteints.

Dans des organismes autres que le poisson zèbre, Angerer et ses collègues ont utilisé des morpholinos conçus pour bloquer la traduction de SpKr1, un facteur de transcription cible pour la régulation de la β-caténine, dans des embryons d’oursins. Comme avec les travaux de Nasevicius et al. , un « knockdown » de l’expression de la GFP a été utilisé comme témoin positif et l’introduction d’un morpholino anti-SpKr1 de 4 µM a entraîné une incapacité de l’endoderme à se différencier. Heasman et coll. ont étudié la signalisation de la β-caténine chez Xenopus. L’injection au stade à 2 ou 4 cellules bloque la formation de l’axe dorsal, tandis que l’injection au stade à 8 cellules bloque la formation de la tête. Enfin, Erickson et ses collègues ont utilisé l’électroporation pour administrer des morpholinos dirigés contre FoxD3 à des embryons de poussins. FoxD3 est un facteur de transcription de classe hélice ailée, et l’introduction de morpholinos modifie la progression des cellules de crête neurale, un résultat compatible avec la localisation de FoxD3. Ces expériences illustrent le potentiel des morpholinos à disséquer finement la progression temporelle du développement. Lors du blocage d’un gène de fonction inconnue ou lors de l’observation d’un résultat imprévu, il est important de garder à l’esprit, cependant, que le nouveau phénotype n’est pas nécessairement dû à une réduction de l’expression du gène cible. Cette mise en garde est également présente pour les ko génétiques standard, et implique simplement que les résultats doivent être interprétés avec prudence.

Ces données sont provocantes et suggèrent que, au moins dans ces modèles animaux, les oligomères antisens morpholino peuvent devenir des outils de routine pour générer des phénotypes mutants. Il est cependant essentiel de réaliser que la technologie antisens reproduit rarement, voire jamais, des mutations complètes de « perte de fonction ». Nous mettons également en garde contre le fait que les réactifs antisens ont été largement utilisés à mauvais escient dans le passé. Les contrôles ont fait défaut, les résultats sont souvent marginaux et les phénotypes observés se sont souvent avérés dus à une grande variété de mécanismes non antisens inattendus. Les causes de ces effets non antisens comprennent des interactions non intentionnelles avec des protéines et la liaison à des séquences d’acides nucléiques non cibles. Il est donc impératif que la méthodologie soit appliquée avec soin pour éviter de répéter les erreurs du passé qui ont ralenti les progrès de la technologie antisens.

Comme pour toute expérience antisens, des contrôles rigoureux des effets non spécifiques sont essentiels pour interpréter correctement les phénotypes. Les expériences utilisant des oligonucléotides morpholino doivent toujours tester au moins un oligomère témoin non apparié et un oligomère témoin brouillé, et les résultats de ces tests doivent être rapportés. Les essais dose-réponse pour déterminer la marge entre l’induction d’un phénotype spécifique et l’apparition de la toxicité sont également importants. Par exemple, cette marge peut être inférieure à deux fois, ce qui souligne la nécessité d’une détermination de la dose soigneusement contrôlée et d’une administration précisément quantifiée. Dans la mesure du possible, les niveaux de la protéine cible et d’une ou plusieurs protéines témoins doivent être évalués dans des échantillons traités avec des morpholinos expérimentaux et témoins. De plus, Ekker suggère que les résultats soient confirmés par le sauvetage d’ARNm et / ou par comparaison avec des phénotypes de mutants existants.

Le taux de réussite élevé de l’inhibition de l’expression des gènes par les oligonucléotides morpholino est surprenant. Le dogme dans le domaine antisens est que le ciblage du site de départ de l’ATG n’est pas une recette certaine pour réussir, et que jusqu’à 40 oligonucléotides peuvent devoir être testés pour en identifier un qui inhibe efficacement l’expression des gènes. Si le ciblage du codon de départ fonctionne si bien, pourquoi plus d’enquêteurs ne le font-ils pas plutôt que de recourir à des écrans élaborés? Les morpholinos peuvent être plus efficaces que d’autres produits chimiques antisens, mais pourquoi? Cette dernière question devra être traitée par une étude systématique de leurs propriétés et une comparaison avec d’autres types d’oligonucléotides. L’épine dorsale morpholino considérablement modifiée peut peut-être se lier plus efficacement à l’ARNm ou agir comme un meilleur blocage de la traduction. Si c’est le cas, les morpholinos pourraient être des agents supérieurs pour l’inhibition des gènes par rapport à d’autres types d’oligomères susceptibles de bloquer la traduction, tels que l’acide nucléique verrouillé (LNA), l’acide nucléique peptidique (PNA) ou l’ARN modifié en 2′. D’autre part, d’autres types d’oligomères pourraient fonctionner aussi bien que, ou mieux que, les morpholinos, mais leur potentiel peut être moins apparent car ils n’ont pas été testés dans des systèmes expérimentaux favorables.

Des observations trompeuses résultant d’interactions non spécifiques ont confondu de nombreuses recherches antérieures utilisant des oligonucléotides. Ces difficultés ont conduit de nombreux chercheurs à être sceptiques quant à l’utilisation des oligonucléotides comme outil de recherche fondamentale. Les travaux publiés au cours des 18 derniers mois suggèrent cependant que les oligomères morpholino pourraient avoir des propriétés qui permettent aux chercheurs de générer régulièrement des phénotypes instructifs. Les résultats sont passionnants, avec l’implication que les oligomères morpholino pourraient fournir un outil généralement applicable pour la génétique chimique et la génomique fonctionnelle. Pour réaliser ce potentiel, il faut déterminer les propriétés qui régissent l’efficacité de ces réactifs. Ces informations permettront aux chercheurs d’optimiser la méthodologie et d’atteindre un « knockdown » maximal d’une cible donnée tout en minimisant les effets confondants et non spécifiques. Les utilisateurs d’oligomères morpholino doivent comprendre les problèmes qui ont affecté le champ antisens dans le passé, apprendre de ces revers et effectuer des expériences de contrôle appropriées. Ces expériences de contrôle, au moins autant que la production de phénotypes intéressants, détermineront si les oligonucléotides morpholino sont la percée suggérée par des recherches récentes.