Abstract

細菌の全ゲノム配列は、副産物として豊富なプロファージ配列を提供し、これらの配列の分析は、ファージが様々な細菌種の宿主細菌のゲノムに影響を与えている方法を明らかにした。 本研究の目的は、家禽の感染性コリザの原因物質であるAvibacterium paragallinarumゲノムのドラフトアセンブリにおけるファージ関連配列を同定することであった。 全ゲノムアセンブリは、連続体の端に存在するギャップおよび/または反復の存在のために不可能であった。 しかし，ゲノムアノテーションにより，このゲノムに存在するプロファージとプロファージ残基配列が明らかになった。 得られた結果から、AvpmuC-2Mと命名された完全なMu様バクテリオファージを同定することができた。AvpC-2M-HP2と命名されたHP2様バクテリオファージの完全な配列も同定された。

1. はじめに

バクテリオファージは、Frederick Wによって1915年にイギリスで最初に発見されました。 1917年、パリのパスツール研究所でフェリックス-ダレルによって独立して設立された。 バクテリオファージは細菌に感染するウイルスであり、細菌細胞との相互作用の手段、すなわち溶解性（病原性）ファージと温帯性（溶解性）ファージに応じて二つのグループに分けることができる。 溶解性ファージは、典型的には、宿主細胞に感染した瞬間に複製を進行し、そこで多数の新しいウイルスが宿主細胞の溶解によって放出される。 温帯ファージは必ずしも感染直後に複製を開始するわけではなく、いくつかの条件に応じて、これらのファージは宿主細胞のゲノムに染色体を統合し、誘導されるまで沈黙している可能性がある。 バクテリオファージゲノムが宿主細胞ゲノムに統合されると、それはプロファージと呼ばれます。 プロファージは、既存の病原体の新しい宿主への適応イベント、または新しい病原体または流行クローンの出現における主要な容疑者である。 細菌に性のライフサイクルがないし、集団内の対立遺伝子の交換は横の遺伝子導入によって達成され、このDNAの源は他の中のファージ、であるかもし 種の障壁によって制限されない限り、全体の機能単位は、これらのソースからインポートすることができ、転送されたDNAは、サイズが1kbから100kb以上の範囲であり、複雑な表面構造、あるいは全体の代謝経路をコードすることができます。 バクテリオファージは、多くの遺伝子がファージを介して細菌間で移動することが示されているため、細菌宿主の病原性に寄与することが長い間確立さ これらの遺伝子は、毒素、調節因子（宿主の病原性遺伝子の発現を上方調節する）、および細菌の病原性成分を変化させることができる酵素などの病原性

細菌の全ゲノム配列決定はprophage配列の豊富を提供しています。 これらのprophagesの多くは不可解と変異崩壊の状態にあるもののProphagesは、細菌のゲノムの10と20％の間に限りを構成することができます。 これらの配列の分析は、プロファージが宿主細菌のゲノムを形成する多くの方法を明らかにした。 Prophagesは、ゲノムの内容を変更することによって、ゲノムの組織を変更することによって、または遺伝子の位置と順序を変更することによって、そのホス 温帯バクテリオファージは、細菌の染色体内の再配列の仲介を通じて微生物の多様性の生成と細菌ゲノムの進化において複雑な役割を果たし、その結果、同じ細菌種内のひずみ間の違いに大きく貢献する。 比較すると、2つの化膿連鎖球菌株は異なるm血清型に属し、それらは無関係に異なる疾患に関連しているが、これらの株をDNAレベルで比較したとき、主な違いはプロファージ配列と相関していた。 別の例はカンピロバクター・ジェジュニ内で観察することができ、ここでは、ひずみ間の違いは、Mu様のprophage DNA配列のゲノム内反転に起因する可能性がある。 共線ゲノム間の比較は、関連するゲノム間のギャップがプロファージ配列の存在または再配置された細菌ゲノムの結果として起因することを示した。 多くの場合、限られたDNA配列同一性を有するプロファージまたは重複プロファージは、相同組換えのためのアンカーポイントとして役立つ。 さらにprophagesはモザイク構造に貢献する他のprophagesと組み直すことができます。

Avibacterium paragallinarumはニワトリを標的とする病原体であり、感染性コリザを引き起こしている。 系統発生的にこの細菌はPasteurellaceae科に属し、以前はHaemophilus paragallinarumとして知られていました2005年に改名されました。 Pasteurellaceae科は密接に関連した細菌で構成されており、この家族の中では、Haemophilus influenzae、Actinobacillus actinomycetemcomitans、Pasteurella multocida、およびMannheimia haemolyticaで様々なバクテリオファージが報告されている。 バクテリオファージ様配列はHistophilus somniで報告されている。 Ａｖで検出されたプロファージとプロファージ残党について述べた。 パラガリナルム

2. 材料および方法

2.1. 細菌株および成長条件

Av。 ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ株Ｃ−２（Ｍｏｄｅｓｔｏ）は、Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ，Ｓｏｕｔｈ Ａｆｆｒｉｃａから得た。 株ModestoはNAD+依存性であり、1％（v/v）鶏血清、1％（v/v）NAD+、および0.0005％（m/v）チアミン溶液を補充し、37℃でキャンドルジャー中の酸素制限条件下で16時間培養したTM/SNで

2.2. DNA抽出

ゲノムDNA抽出は、QiagenのQIAamp DNA Mini kitを使用して行われました。 ゲノムＤＮＡを２×８ ０μ ｌの１ ０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ８中で溶出した溶出手順を除いて、製造業者の推奨に細心の注意を払って従った。2.3.

Avの識別. paragallinarum

Av. ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍはこの細菌のために特別に開発されたＰＣＲプロトコルを用いて同定した。 さらに、Ａｖを同定するために、１ ６ＳリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）領域を増幅した。 パラガリナルム 得られたPCR産物をアガロースゲルから切除し、精製し、外来ゲノムDNA汚染の可能性を避けるために直接配列決定した。 2.4.

ゲノムアセンブリと注釈

AvのゲノムDNAサンプル。 ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ株Ｃ−２（Ｍｏｄｅｓｔｏ）を、ＧＳ−ＦＬＸチタンパイロシークエンスのために、ドイツのＡｇｏｗａ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（現在はＬＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓとして知られている）に送った。 パイロシークエンスから得られた配列/読み取りは、90％の重複最小一致同一性および40塩基の重複最小一致長を有する454Life Sciences CorporationからNewbler2.0.01.14を使用して組 得られた連続体の配列は、注釈のための擬似分子としてJ.Craig Venter Institute（JCVI）に提出された。 パイプラインには、Glimmerによる遺伝子発見、BLAST-Extend-Repraze（BER）検索、隠れマルコフモデル（HMM）検索、トランス膜隠れマルコフモデル（TMHMM）検索、SignalP予測、AutoAnnotateからの自動注釈が含まれています。 この情報のすべては、当社のサイトにダウンロードされたMySQLデータベースと関連ファイルに格納されています。 手動注釈ツールManateeはSourceForge(http://manatee.sourceforge.net/)からダウンロードされ、パイプラインからの出力を手動で確認するために使用されました。 ACACLONEソフトウェアからpdraw32は、prophage領域の遺伝的マップを描画するために使用されました。2.5.

アクセッション番号

AvpmuC-2M(アクセッション番号。 Ａ（ｊｎ６ ２ ７ ９ ０ ６）、Ｂ（ＪＮ６ ２ ７ ９ ０ ７）、およびＣ（ＪＮ６ ２ ７ ９ ０ ８）のようなＨＰ−２；ランボイドのプロファージ断片（受託番号：ＪＮ６ ２ ７ ９ ０ ９−ＪＮ６ ２ ７ ９ １ ９）；プロファージインテグラーゼ遺伝子（受託番号：ＪＮ６ ２ ７ ９ ２ ０−ＪＮ６ ２ ７ ９ ２ ８）。

3. 結果と議論

Avの全ゲノムシーケンスプロジェクト。 paragallinarumは、パイロシークエンス化学を介して160 743読み取り/配列の総数をもたらした。 これらの配列から組み立てられたコンティグの総数は300であり、最大コンティグは78 465bpを含み、平均コンティグサイズは500bpよりも長い10 727bpであった。 閉鎖ゲノムはＡ ｖのために組み立てることができなかった。 paragallinarumは、連続体の末端に存在する繰り返し配列または連続体間の配列ギャップの結果として得られた配列決定結果から得られた。 Pseudogenome分子は得られた300のcontigsから組み立てられ、ゲノムの注釈のためのJCVIに送られました。 注釈の結果は、7％または141オープンリーディングフレームの合計がファージタンパク質機能に割り当てられたことを示した。 141オープン読み取りフレームは、いずれかのいずれかまたはプロファージ遺伝子のシリーズがマッピングされた60の300連続で同定された。 ナインprophageインテグラーゼ遺伝子が同定され、60連続の七つにマッピングされました。 同定されたインテグラーゼに隣接するオープンリーディングフレームへの調査は、追加のprophage関連遺伝子ではなく、膜タンパク質をコードする遺伝子を明らかに; 細胞膜機能蛋白質、または膜の輸出蛋白質。 インテグラーゼ間に有意な相同性は観察されなかった。

Mu様prophage遺伝子が同定され、11の異なる連続にマッピングされました。 11の連続はによって報告されたMu様ファージのゲノムマップと比較された。 ここでは、Avの推定Muのようなprophageを提案します。 paragallinarum,AvpmuC-2M(図1). Mu遺伝子（25）の大部分は、27、107bpを含む単一のコンティグ上で同定された。 二つの追加のcontigsは、AvのためのMuのようなprophageのマップを完了することが同定されました。 パラガリナルム

図1

AvpmuC-2Mの推定ゲノム表現。AvpmuC-2Mの構築に使用された三つの連続は//で区切られています。 コンティグのサイズは、塩基対で各コンティグの下に示されています。

四十から一ランボイド遺伝子は、11の異なる連続にマッピングされました（図2）。 全ゲノムシークエンシングプロジェクトから入手可能なデータでは、ランボイドプロファージが完了しているか、バクテリオファージのゲノム断片化をもたらし、最終的にその消失につながる機能的なDNAの大規模な損失を受けている場合、それは結論付けることができませんでした。

図2

ランボイド遺伝子表現。 様々なラムダ遺伝子は、それらが同定され、関連する機能に従ってグループ化された連続体にマッピングされている。 連続の始まりと終わりは//で示されます。

温帯ファージの完全な溶解原がゲノム内の単一のコンティグ上で同定された。 同定された遺伝子の連続は、h.influenzae HP2prophageのそれに似ています。 ヌクレオチド間のヌクレオチド比較は、h.influenzae prophage HP2と同定されたprophageの間に弱い類似性を明らかにした。 したがって、識別されたprophageはAvに固有のものです。 パラガリナルム それをAvpC-2M-HP2と呼ぶことをお勧めします。

二つの追加の連続体には、HP2様遺伝子も含まれていました（図3）。 同定された連続体（AcpC-2M-HP2のA、B、およびC）間の類似性のさらなる調査は、三つの連続体が同じゲノム組織を共有するが、それらは同一ではないこと

(a)

(b)

(c)

(c)

(c)

(a)
(b)
(c)

他のプロファージ遺伝子の豊富さも同定されているが、特定のファージまたはファージファミリーに割り当てることができませんでした。

したがって、発見されたすべてのprophage遺伝子のマッピングは、Avにおける二つのprophageを示唆することを可能にした。

パラガリナルム 一つのプロファージ、AvpmyC-2Mは、他のプロファージ、AvpC-2M-HP2は、h.influenzaeのHP2プロファージに似ているのに対し、Muのようなプロファージに似ています。

利益相反

著者らは、論文内で言及されている商業的アイデンティティのいずれとも利益相反は存在しないと宣言しています。

謝辞

著者は、自動注釈データと手動注釈ツールManateeを提供したJCVI注釈サービスを提供してくれたJCVIに感謝したいと思います。